基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網絡藥理學探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機制

姜 晨，徐榮佳，崔師妍，徐鵬昊，夏澤魯，楊洪濤

基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網絡藥理學探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機制

姜 晨，徐榮佳，崔師妍，徐鵬昊，夏澤魯，楊洪濤*

天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心 腎病科，天津 300384

采用高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（HPLC-Q-TOF-MS/MS）挖掘益腎化濕顆粒的主要成分，并結合網絡藥理學探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的作用靶點及機制。采用質譜技術對益腎化濕顆粒主要成分進行準確定性，并運用TCMSP、ETCM、SymMAP數據庫獲得活性成分靶點；采用GeneCards、OMIM等數據庫獲得IgA腎病的疾病靶點，對藥效疾病靶點進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，進一步運用Cytoscape_v3.8.2構建“活性成分-靶點-通路”網絡；應用Atuodock軟件對篩選靶點及主要活性成分進行分子對接，進行結合位點模擬驗證。共鑒定出益腎化濕顆粒主要成分68個，包括香豆素類、三萜類和黃酮類等化合物；共獲得益腎化濕顆粒治療IgA腎病活性成分43個，活性成分與疾病交集靶點74個，其中包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ、皮質醇受體基因等；涉及通路包括腫瘤壞死因子信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路、晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路等。分子對接結果顯示，柴胡皂苷A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、澤瀉醇A與IgA腎病的預測靶點有良好的結合活性。益腎化濕顆粒能夠通過抗炎、調節免疫、改善類固醇效應等治療IgA腎病，具有多成分、多靶點、多途徑的特點。

益腎化濕顆粒；IgA腎病；HPLC-Q-TOF-MS/MS；網絡藥理學；柴胡皂苷A；黃芪甲苷III；黃芪甲苷IV；澤瀉醇A

IgA腎病是我國乃至世界范圍內最常見的慢性進展性原發性腎小球疾病。盡管大部分患者呈良性進展，但仍有10%～25%的患者于10年后進展至終末期腎臟病，因其難治性及發展迅速的特點，嚴重影響著公眾健康。目前其復雜的發病機制尚未完全闡明，有效的治療方法（如糖皮質激素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統阻斷劑等）仍存在爭議。近30年，中醫藥治療IgA腎病療效顯著，并在藥理學、多系統組學研究等方面取得重大進展。因此，在難治性慢性腎臟病領域發揮中醫藥優勢，深入探索中醫藥治療IgA腎病的有效方法及藥物確切作用機制意義重大。

益腎化濕顆粒的主要藥效物質包含香豆素類、三萜類和黃酮類等成分。目前文獻報道了以現代色譜技術鑒定益腎化濕顆粒中重要藥味的化學成分，如盧秋梅等[1]以薄層色譜法定性和高效液相色譜法測定處方中人參、黃芪、甘草、黃連、陳皮、獨活、白芍的主要化學成分。但由于鑒定的藥物數目不全、藥物化學成分數目較少等原因，尚不能較系統地反映益腎化濕顆粒的整體化學成分特征。目前，由于中藥復雜體系的科學內涵與中藥“多成分、多靶點”的物質基礎和作用機制，網絡藥理學在復方優化、中藥活性成分篩選及辨識等方面表現出了極大的優勢，為進一步研究提供了重要手段。

基于此，本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜法（HPLC-Q-TOF-MS/MS），并以鑒定得到的化學成分為切入點，利用網絡藥理學方法預測其預防或治療IgA腎病的活性成分和作用靶點，通過基因本體（gene ontology，GO）數據庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫分析其作用特點，進一步采用分子對接技術對活性成分和關鍵靶點進行驗證，為深入研究益腎化濕顆粒主要活性成分治療IgA腎病的藥效物質基礎及作用機制提供數據支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑

益腎化濕顆粒（10 g/袋，批號20201118）購自廣州康臣藥業有限公司；色譜級甲酸購自阿拉丁公司；乙醇（分析純）購自購自北京化工廠；純水使用Mill-Q純水機制備。

1.2 儀器

HPLC-Q-TOF-MS/MS（美國Waters公司）；萬分之一電子天平（海精密科學儀器有限公司）；渦旋儀（北京優晟聯合科技有限公司）；離心機（美國Sigma公司）；移液槍（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SHIZ-95B型循環式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.3 數據庫與軟件

中藥系統藥理分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/）；ETCM網站（www.tcmip.cn/ etcm/index.php/ home/index/index.html）；SymMAP網站（http://www.symmap.org/）；Meatascape網站（https://metascape.org/gp/index.html）；Genecards數據庫（https://www.genecards.org）；OMIM數據庫（http://www.omim.org）；Pharmgkb數據庫（https:// www.pharmgkb.org）；TID數據庫（http://db.idrblab. net/ttd）；DrugBank數據庫（https://www.drugbank. ca）；Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org）；RCSB蛋白質數據庫（https://www.rcsb.org/）；PubChem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；Cytoscape 3.7.2軟件；Autodock Vina 1.5.6軟件；MassLynx V4.2軟件；Pymol 2.5.1軟件。

2 方法

2.1 供試品的制備

取益腎化濕顆粒（碾成粉末）100 mg，置于10 mL量瓶內，加入水適量，超聲溶解，放冷至室溫后定容，得到質量濃度為10 mg/mL的溶液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液于4 ℃保存。

2.2 色譜條件

Waters X select HSS T3 C18色譜柱（210 mm×1.8 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；樣品室溫度為4 ℃；進樣體積為5 μL；載氣體積流量為3.0 L/min；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），洗脫程序：0～11 min，16% B；11～22 min：6%～28% B；22～32 min，28%～47% B；32～40 min，7%～63% B；40～42 min，63%～85% B；42～48 min，85%～100% B；48～50 min，1% B。

2.3 質譜條件

電噴霧離子源，V模式；正、負離子模式；負離子模式：Lockmass采用LEA（[M－H]?553.277 5）；正離子模式：Lockmass采用LEA（[M＋H]＋555.293 1）。毛細管電壓為2.5 kV；錐孔電壓為45 V；離子源溫度為100 ℃；脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氮氣體積流量為600 L/h；錐孔氣體積流量為50 L/h；采樣頻率0.1 s，間隔0.02 s；/50～1700；碰撞能為21 eV。

2.4 益腎化濕顆粒活性成分和靶點篩選

以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為篩選條件，利用PubChem數據庫獲得成分的分子式，在TCMSP、ETCM、SymMAP數據庫搜集益腎化濕顆粒活性成分，通過挖掘文獻補充靶點。

2.5 IgA腎病疾病靶點篩選

IgA腎病疾病靶點的搜集以“IgA nephropathy”為關鍵詞，檢索5個疾病靶點數據庫（Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、DrugBank），通過Uniprot數據庫將靶點蛋白信息轉化為Uniprot ID，合并重復靶點基因，與獲得的成分靶點基因進行比對獲取交集靶點。

2.6 互作關系靶點關系與信號通路分析

將IgA腎病、益腎化濕顆粒主成分交集靶點經metascape平臺注釋進行蛋白互作（protein protein interaction，PPI）分析，應用MCODE算法識別PPI網絡內的模塊。對每個模塊進行通路和過程富集分析，對其進行功能進行描述。并通過metascape平臺輸出的KEGG及GO分析結果輸入cytoscape軟件進行可視化。

2.7 活性成分與靶點的分子對接驗證

利用Atuodock軟件對潛在作用靶點和活性成分進行分子對接。選擇度值≥5、OB≥30%，從RCSB蛋白質數據庫（https://www.rcsb.org/）下載候選蛋白的晶體結構，從PubChem數據庫獲得活性成分的二維結構文件，通過去水、加氫、轉換格式，對接結果參考結合能大小，對接能量值≤?25.10 kJ/mol表示有較好的結合活性，利用Pymol軟件對結果進行輸出優化。

3 結果

3.1 益腎化濕顆粒成分鑒定

益腎化濕顆粒的提取總離子流圖（total ion chromatography，TIC）見圖1，通過對負離子模式的成分解析，MassLynxV4.2工作站得到可能的元素組成，對誤差小于10以內的分子式進行文獻匹配，共獲得68個主峰化合物，包括香豆素類化合物（A）、三萜類化合物（B）、黃酮類化合物（C）、苷類化合物（D）、異喹啉類生物堿（E）、內酯類化合物（F）、醇類化合物（G）、酚類化合物（H）、有機酸類化合物（I），結合出峰先后進行順序標號見表1，與文獻報道益腎化濕顆粒的主要藥效物質基礎一致[1]。

圖1 正離子模式下益腎化濕顆粒總離子流圖

表1 益腎化濕顆粒成分鑒定

續表1

峰號來源化合物tR/min分子式相對分子質量m/zMS/MS編號 理論值實際值 57羌活香豆酸39.81C6H4O4140.092 3141.093 3141.092 675.443 9, 53.240 3F3 58生姜10-姜辣醇40.28C21H34O4350.490 8351.492 0351.491 8213.368 9, 138.089 9G1 59陳皮檸檬苦素40.41C26H30O8470.511 6471.513 3471.513 8369.454 9, 287.080 5B18 60人參人參皂苷Rb243.56C53H90O221 079.262 11 080.263 61 080.263 9433.188 9, 369.488 5, 263.194 5B3 61生姜6-姜烯酚43.60C17H24O3276.372 6277.373 6277.373 7124.736 7, 64.723 4G3 62黃芪黃芪皂苷II43.82C43H70O15827.002 4828.003 6828.003 9385.601 3, 68.367 9B12 63黃芪黃芪甲苷44.12C41H68O14784.971 6785.973 7785.973 2204.458 5, 148.422 6B14 64黃連藥根堿44.52C20H20NO4338.382 1339.383 9339.383 9243.499 4, 130.822 7E2 65黃芪黃芪皂苷III44.55C43H70O15827.002 4828.002 4828.003 0468.041 9, 268.200 0B13 66甘草異甘草苷45.28C21H22O9418.392 6419.394 2419.393 8366.681 1, 109.463 8C9 67人參人參皂苷Re45.70C48H82O18947.151 0948.151 4948.151 3498.586 3, 420.388 4, 197.679 9B4 68茯苓茯苓酸49.10C33H52O5528.761 3529.761 7529.761 9434.552 7, 248.597 9B6

3.2 益腎化濕顆粒活性成分和作用靶點篩選

由表1可知，益腎化濕顆粒主要成分包括芍藥苷、柴胡皂苷A、白術內酯I、白術內酯II、白術內酯III、人參皂苷Rg1、黃芪皂苷、茯苓酸等，基本反映了益腎化濕顆粒的化學物質組成。選取鑒定的全部益腎化濕顆粒活性成分作為目標成分，其中61個成分被PubChem數據庫收錄，利用TCMSP、ETCM、SymMAP數據庫，獲取235個成分的相關靶點。另外7個成分如紫花前胡苷元、去甲升麻素、5-去甲川陳皮素等由于相關研究不多，未找到作用靶點。構建“活性成分-靶點-通路”網絡，結果表明有43個成分參與調控IgA腎病的分子網絡，其中茯苓酸、川陳皮素等在調控網絡中影響程度較大，同時具有良好的OB，可為益腎化濕顆粒預防或治療IgA腎病提供新的活性成分。

3.3 IgA腎病疾病靶點篩選

以“IgA nephropathy”為關鍵詞，檢索5個疾病靶點數據庫（Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、Drug Bank），得到1415個與IgA腎病相關的作用靶點，通過Uniprot數據庫將靶點蛋白信息轉化為Uniprot ID，合并重復靶點基因，與獲得的成分靶點基因進行比對，最終獲得74個治療IgA腎病潛在的靶點基因（圖2），并經metascape平臺注釋進行PPI分析，應用MCODE算法識別PPI網絡內的模塊。對每個模塊進行通路和過程富集分析，對其進行功能進行描述。根據值，保留3個最佳評分項描述相應模塊的功能（圖3），主要與急性炎癥反應、血管內皮生長因子正向調節、CD4＋T細胞因子產生、生長發育、白細胞分化等過程相關，其中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、谷胱甘肽硫轉移酶P1（glutathione S-transferase pi-1，GSTP1）、IL-1β、核受體亞家族3C組成員2（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、核受體視黃酸X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRA）、原癌基因（JUN）、核因子-κB（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）為篩選的核心靶點。

圖2 藥物與疾病交集靶點Venn圖

圖3 藥物與疾病交集靶點PPI分析

3.4 互作靶點及通路分析

GO功能注釋是通過生物過程（cellular component，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）對基因進行注釋和分類。如圖4所示，交集靶點涉及藥物反應、類固醇激素反應及結合、急性炎癥反應、脂質反應、氧化應激、抑制細胞增殖、白細胞分化等20個BP條目；膜筏、薄膜側面、無花果酶1顆粒、細胞質小泡腔、囊泡腔等9個CC條目；轉錄因子活性、蛋白質結構域特異性結合、類固醇激素受體活性等13個CC條目。

圖4 交集靶點GO富集分析

對BP富集條目展示對應藥效靶點，其中GSTP1與炎癥、脂代謝、營養及藥物反應密切相關（圖5）。谷胱甘肽硫轉移酶家族在解毒和抗氧化防御系統中發揮重要作用，可通過調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、NF-κB、信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的相互作用參與抗炎、促凋亡過程，在以系膜細胞增殖為主的IgA腎病中提供潛在的治療機制。

圖5 BP富集條目對應靶點

如圖6所示，益腎化濕顆粒可能通過作用于脂質與動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、TNF信號通路、晚期糖基化產物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信號通路、IL-17信號通路等治療IgA腎病。

圖6 交集靶點KECG富集分析

3.5 “活性成分-靶點-通路”網絡的構建

選擇KEGG通路富集結果前20條中的與IgA腎病發生、發展相關的14條信號通路，集中展示活性成分對作用靶點的所在通路。43個主要活性成分可能通過作用于74個靶點，在14條信號通路中發揮作用，繪制益腎化濕顆粒“活性成分-疾病-通路”的網絡交互機制圖（圖7）。

3.6 益腎化濕顆粒活性成分與作用靶點的分子對接

利用Atuodock軟件對潛在作用靶點和活性成分進行分子對接，結果表明活性成分中均與8個核心蛋白結合能均≤?25.10 kJ/mol，柴胡皂苷A與TNF結合能最高為?39.71 kJ/mol，澤瀉醇A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷Ⅳ、柴胡皂苷A、人參皂苷結合能較高（表2），部分蛋白和化合物的分子對接情況見圖8。

圖7 “活性成分-靶點-通路”網絡

表2 核心活性成分與核心蛋白結合能

圖8 部分蛋白和化合物的分子對接圖

4 討論

益腎化濕顆粒為李杲《脾胃論》之名方“升陽益胃湯”化裁而來，此方乃東垣治所生受病肺經之方，后世在臨床實踐中逐漸擴大了此方的應用范圍，將此方用于治療IgA腎病便是其中之一。IgA腎病在中醫學屬“尿血”“水腫”“腎風”“尿濁”等范疇，以本虛標實為基本病機特點，本虛以脾腎氣虛為主，標實以濕熱及水濕之邪為常。國醫大師張琪教授強調脾胃失調是慢性腎病的病機關鍵，善于以脾論治慢性腎臟病[2]。楊洪濤教授傳承發展了張琪教授從脾治腎思想，探索以益腎化濕顆粒治療IgA腎病[3]。益腎化濕顆粒中重用黃芪為君，以升陽固表、益氣利水；配伍人參、白術、茯苓、炙甘草補氣養胃；柴胡、獨活、羌活、防風為升舉清陽、祛風除濕；半夏、陳皮、澤瀉、黃連除濕清熱；白芍固護陰液，防升陽祛風燥濕太過；全方共奏益腎健脾、升陽化濕、祛風利水之功效。既往臨床與動物實驗研究顯示，益腎化濕顆粒可調節慢性微炎癥狀態、改善內皮細胞功能、減輕氧化應激損傷，從而發揮腎臟保護作用[4-8]。本研究發現益腎化濕顆粒的43個活性成分與74個IgA腎病疾病靶點密切相關，并通過14條信號通路發揮作用。分子對接結果顯示，黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、柴胡皂苷A、人參皂苷、澤瀉醇A等活性成分與IgA腎病的關鍵靶點對接分數較高，表明有良好的的結合活性。根據網絡拓撲結合PPI分析，得到益腎化濕顆粒可通過TNF、IL-6、IL-1β、PPARγ、GSTP1、NF-κB、NR3C1、RXRA、JUN等9個核心基因調控IgA腎病。

脾虛證是IgA腎病中醫病機本虛證的主要體現，脾虛運化障礙下，水谷精微轉運異常，引發能量代謝障礙，可促使線粒體功能及結構發生改變，健脾益氣之法可調控線粒體自噬水平，在修復IgA腎病損傷組織中起調節作用[9]。PI3K/Akt通路是參與細胞自噬與調亡的關鍵通路，過度激活進而促進β-鏈蛋白核移位介導細胞增殖，在IgA腎病患者B淋巴細胞、系膜細胞及單核細胞增殖發揮作用[10]。PI3K亦可激活單核細胞其表面受體CD89，變體后與聚合性IgA形成IgA1-CD89免疫復合物，影響IgA腎病疾病進展[11]。PI3K/Akt通路的下游分子腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）介導轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）/STAT3通路促進IgA腎病腎間質纖維化[12]。黃芪甲苷可通過調控PI3K/Akt/p53信號通路抑制IgA腎病腎小球系膜細胞增生[13]。GSTP1可抑制PI3K/Akt誘導的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的激活而促進自噬下調炎癥小體水平，保護線粒體免受氧化應激損害[14]，本研究發現GSTP1是益腎化濕顆粒作用的關鍵基因之一，體現了健脾益氣藥物用以治療IgA腎病的重要靶點。此外，脾虛證影響B細胞抗體表達使體液免疫功能異常，表現為免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）和補體的含量異常[15-16]。糖皮質激素通常作為IgA腎病有效的治療方式來調控免疫。皮質醇受體基因NR3C1不僅反饋糖皮質激素功能，并作為其他轉錄因子的調節器，影響炎癥反應、細胞增殖和目標組織的分化[17]。在IgA腎病患者中，NR3C1影響IgA腎病異常表達的各種下游分子[18]，本研究發現，益腎化濕顆粒中人參皂苷、茯苓酸、澤瀉醇A等多種成分均可與皮質醇受體基因NR3C1有效對接，提示益腎化濕顆粒有助于發揮糖皮質激素效能。

“風濕擾腎”是IgA腎病中免疫炎癥啟動系膜細胞活化的病機關鍵，該環節與活動期/進展期IgA腎病病理損傷密切相關。“風”“濕”等致病因素在現代醫學中被認為是導致免疫炎癥反應的重要因素。本研究中黃芪主要成分黃芪皂苷可通過調控TGF-β1/Smad通路激活，調控p38活化和NF-κB的表達，從而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達，減輕炎癥反應[19]。白術所含的白術內酯I調控CD14、TLR4和MyD88的表達，抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎性因子水平，減弱NF-κB的活性和細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）和p38 MAPK的磷酸化，并通過抑制TNF-α和IL-6的產生，從而發揮抗炎作用。柴胡皂苷A可抑制c-Jun/MAPK、NF-κB的通路信號轉導繼而減輕炎癥反應[20-22]。黃芪甲苷作為經典抗炎、調節免疫單體可以減輕IL-1β及NF-κB的釋放，發揮腎保護作用[23]。以上結果闡述為益腎化濕治療IgA腎病關鍵靶點提供了堅實的藥效基礎。

PPAR家族調控參與細胞增殖、分化以及炎癥和免疫相關蛋白的表達。PPARγ主要在脂肪組織、腸、腎上皮和免疫系統中表達，其編碼蛋白PPARγ可抑制p65的磷酸化和核易位從而調控NF-κB表達，進一步降低TNF-α水平，在炎癥反應及IgA腎病的發生和發展中發揮重要作用[24]。PPAR家族（PPARα、PPARβ及PPARγ）同時也是參與調控脂肪細胞分化和葡萄糖穩態關鍵細胞因子[25]。脂代謝紊亂常與腎功能及腎間質纖維化有直接關系，是IgA腎病進展關鍵危險因素。RXRA則是PPAR家族通路激活關鍵轉錄因子[26]，抑制PPARa/RXRA通路，氧化脂肪酸水平下調繼而血清三酰甘油水平升高，促進IgA腎病腎小球硬化進展[27-28]。本研究顯示益腎化濕顆粒中的茯苓酸、黃芪皂苷、澤瀉醇A、川陳皮素等均能與PPARγ對接，發揮調控免疫炎癥及維持細胞脂代謝穩態作用。

本研究還發現益腎化濕顆粒可通過調控TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路等發揮治療作用。其中TNF、IL-6、IL-1β、NF-κB均為重要的免疫、炎癥因子，PPARγ、RXRA、GSTP1為介導代謝環節的效應因子，RXRA為PI3K/Akt信號通路的關鍵靶點，介導的信號通路與IgA腎病的炎癥反應和脂代謝過程密切相關。免疫、炎癥與代謝三方失調參與IgA腎病病理損傷的全過程，本研究發現這些關鍵蛋白也均顯著富集在TNF信號通路、IL-17信號通路等5條信號通路上，從一定程度上展示了益腎化濕顆粒能夠多靶點、多通路預防或治療IgA腎病。

綜上所述，益腎化濕顆粒中的活性成分與炎癥、代謝、免疫調節等相關蛋白成功對接，可調控TNF、PI3K/Akt、IL-17、AGE-RAGE等多條關鍵信號通路，通過抗炎、調節免疫、代謝、改善類固醇效應等過程協同治療IgA腎病。基于網絡藥理學與分子對接技術預測結果與已有文獻結果較為接近，體現出本研究結論的科學性，可為深入闡釋益腎化濕顆粒治療IgA腎病的物質基礎和作用機制提供依據。本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網絡藥理學探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的潛在機制，為進一步明確益腎化濕顆粒治療IgA腎病提供了理論依據和研究方向，益腎化濕顆粒具體作用靶點將在后續實驗中進行驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 盧秋梅, 黎倩, 黃艷霞, 等. 益腎化濕顆粒質量標準提高研究 [J]. 中國藥業, 2020, 29(13): 80-84.

[2] 李蓮花, 張佩青. 張琪教授從脾胃治療慢性腎臟病的經驗 [J]. 中國中西醫結合腎病雜志, 2016, 17(5): 386-387.

[3] 王耀獻, 楊洪濤, 裴明. 益腎化濕顆粒治療腎臟病臨床應用專家共識 [J]. 中華腎病研究電子雜志, 2020, 9(3): 97-101.

[4] 胡漪玲, 關文明, 徐偉芹. 益腎化濕顆粒聯合舒洛地特對早期老年糖尿病腎病氧化應激及內皮功能的影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2016, 22(5): 211-214.

[5] 張國勝, 侯小靜, 朱廣領. 益腎化濕顆粒和舒洛地特軟膠囊聯合治療糖尿病腎病的療效 [J]. 中國老年學雜志, 2014, 34(24): 6910-6912.

[6] 劉秀艷. 益腎化濕顆粒聯合纈沙坦對尿毒癥患者微炎癥狀態及殘存腎功能的影響 [J]. 河北醫藥, 2017, 39(14): 2143-2145.

[7] 張玥. 益腎化濕顆粒聯合纈沙坦治療慢性腎小球腎炎的臨床研究 [J]. 世界中醫藥, 2017, 12(1): 68-70.

[8] 傅奕, 陳幫明, 李鑫, 等.益腎化濕顆粒聯合雷公藤多苷片治療糖尿病腎病的療效研究[J]. 中草藥, 2020, 51(23): 6045-6049.

[9] Wu C Y, Hua K F, Yang S R,. Tris DBA ameliorates IgA nephropathy by blunting the activating signal of NLRP3 inflammasome through SIRT1- and SIRT3- mediated autophagy induction [J]., 2020, 24(23): 13609-13622.

[10] Cox S N, Sallustio F, Serino G,. Altered modulation of WNT-beta-catenin and PI3K/Akt pathways in IgA nephropathy [J]., 2010, 78(4): 396-407.

[11] 方心縈, 金善善, 王小琴. IgA腎病分子機制研究進展 [J]. 臨床腎臟病雜志, 2018, 18(12): 784-787.

[12] Yang R H, Xu X, Li H L,. p53 induces miR199a-3p to suppress SOCS7 for STAT3 activation and renal fibrosis in UUO [J]., 2017, 7: 43409.

[13] 龐爽, 趙栓, 徐夏蓮, 等. 基于網絡藥理學和體外細胞實驗分析黃芪治療IgA腎病的作用機制 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2021, 27(15): 139-147.

[14] Dong X, Yang Y, Zhou Y,. Glutathione S-transferases P1 protects breast cancer cell from adriamycin-induced cell death through promoting autophagy [J]., 2019, 26(10): 2086-2099.

[15] 朱萱萱, 嚴士海, 顧和亞, 等. 溫脾實腸法治療脾陽虛證實驗研究: 兼論對免疫系統功能的影響 [J]. 實用中醫內科雜志, 2007, 21(9): 27-29.

[16] 聶建華, 歐陽文娟, 阮時寶, 等. 土人參根健脾益氣功效及其作用機制的實驗研究 [J]. 中國中醫藥科技, 2009, 16(3): 200-201.

[17] Cartwright T, Perkins N D, L Wilson C. NFKB1: A suppressor of inflammation, ageing and cancer [J]., 2016, 283(10): 1812-1822.

[18] Cox S N, Pesce F, El-Sayed Moustafa J S,. Multiple rare genetic variants co-segregating with familial IgA nephropathy all act within a single immune-related network [J]., 2017, 281(2): 189-205.

[19] 趙夏, 許傳文, 徐艷梅. 黃芪皂苷調節TGF-β1/Smad通路對尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2019, 35(4): 24-28.

[20] Lai K N, Leung J C, Chan L Y,. Activation of podocytes by mesangial-derived TNF-alpha: Glomerulo- podocytic communication in IgA nephropathy [J]., 2008, 294(4): F945-F955.

[21] Qui?ones M, Al-Massadi O, Folgueira C,. p53 in AgRP neurons is required for protection against diet-induced obesity via JNK1[J]., 2018, 9(1): 3432.

[22] Tolstonog G V, Deppert W. Metabolic sensing by p53: Keeping the balance between life and death [J]., 2010, 107(30): 13193-13194.

[23] 韓海燕. 黃芪甲苷治療慢性腎臟疾病研究進展 [J]. 長春中醫藥大學學報, 2017, 33(4): 678-680.

[24] Liu B, He Y, Lu R,. Zhen-wu-tang protects against podocyte injury in rats with IgA nephropathy via PPARγ/NF-κB pathway [J]., 2018, 101: 635-647.

[25] Wang J, He L, Yan W,. The role of hypertriglyceridemia and treatment patterns in the progression of IgA nephropathy with a high proportion of global glomerulosclerosis [J]., 2020, 52(2): 325-335.

[26] Gorla-Bajszczak A, Juge-Aubry C, Pernin A,. Conserved amino acids in the ligand-binding and tau(i) domains of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha are necessary for heterodimerization with RXR [J]., 1999, 147(1/2): 37-47.

[27] Zuo N, Suzuki Y, Sugaya T,. Protective effects of tubular liver-type fatty acid-binding protein against glomerular damage in murine IgA nephropathy [J]., 2011, 26(7): 2127-2137.

[28] Xue Y F, Guo C Z, Hu F,. PPARA/RXRA signaling regulates the fate of hepatic non-esterified fatty acids in a sheep model of maternal undernutrition [J]., 2020, 1865(2): 158548.

Mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy based on HPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

JIANG Chen, XU Rong-jia, CUI Shi-yan, XU Peng-hao, XIA Ze-lu, YANG Hong-tao

National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Department of Nephrology, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300384, China

To discover the main components of Yishen Huashi Granules (益腎化濕顆粒) by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS/MS), and explore the target and mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy by network pharmacology.Mass spectrometry was used to accurately characterize the main components of Yishen Huashi Granules, and the active component targets were obtained by TCMSP, ETCM, and SymMAP databases; Disease targets of IgA nephropathy were obtained by GeneCards, OMIM and other databases, gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on drug-effective disease targets, and “active ingredients-targets-pathway” network was further constructed by Cytoscape_v3.8.2; Atuodock software was used for molecular docking of screening target and main active ingredients, and binding site simulation verification was carried out.A total of 68 main components of Yishen Huashi Granules were identified, including coumarins, triterpenoids, and flavonoids. A total of 43 active components of Yishen Huashi Granules for treating IgA nephropathy were obtained, 74 targets were obtained at the intersection of active ingredients and diseases, including peroxisome proliferator-activated receptor γ, cortisol receptor genes, etc.; Tumor necrosis factor signaling pathway, phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway, advanced glucose glycation products-advanced glycation end products receptor signaling pathway were involved. Molecular docking results showed that saikosaponin A, astragaloside III, astragaloside IV, alisol A had good binding activity with the predicted targets of IgA nephropathy.Yishen Huashi Granules can treat IgA nephropathy through anti-inflammatory, immune regulation and steroid effects. It has the characteristics of multiple components, multiple targets and multiple pathways.

Yishen Huashi Granules; IgA nephropathy; HPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; saikosaponin A; astragaloside III; astragaloside IV; alisol A

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6576 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.016

2021-09-23

益腎化濕顆粒臨床應用研究和基礎研究開放課題（康藥合字2020336）

姜 晨（1982—），女，博士，副主任醫師，博士生導師，研究方向為中西醫結合治療腎臟病。Tel: 18622662919 E-mail: jcdoctor_tcm@163.com

楊洪濤（1963—），男，主任醫師，教授，博士生導師，研究方向為中西醫結合治療腎臟病。Tel: (022)27986565 E-mail: tjtcmht@126.com

[責任編輯 李亞楠]