天佛參口服液對A549細胞體內外增殖的影響及機制研究

張丹丹，翟云良，季 芳，張亞云，夏 揚，李 全，王恒斌

天佛參口服液對A549細胞體內外增殖的影響及機制研究

張丹丹，翟云良#，季 芳，張亞云，夏 揚，李 全，王恒斌*

雷允上藥業集團有限公司，江蘇 蘇州 215009

探究天佛參口服液對人非小細胞肺癌A549細胞與裸鼠移植瘤增殖的作用以及相關作用機制。采用Cell Titer-Glo發光法檢測天佛參口服液對9種不同基因突變表型的肺癌細胞系增殖的抑制作用；采用流式細胞術檢測天佛參口服液對A549細胞周期及凋亡的影響；采用Western blotting法考察天佛參口服液對A549細胞增殖相關蛋白表達的影響。裸鼠sc A549細胞建立裸鼠移植瘤模型，考察天佛參口服液對小鼠皮下移植瘤生長的影響。天佛參口服液抑制A549細胞增殖，呈劑量相關性；天佛參口服液阻滯A549細胞周期于G0/G1期和G2/M期（＜0.05、0.01），并且1%天佛參口服液可以顯著誘導A549細胞凋亡（＜0.01）；天佛參口服液顯著抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Raf、絲裂原細胞外信號調節激酶（mitogen extracellular signal-regulated kinase，MEK）以及細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）蛋白的磷酸化水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關性。體內實驗結果顯示，2.25 mL/kg天佛參口服液對裸鼠移植瘤模型的腫瘤體內生長具有顯著抑制作用（＜0.05）。天佛參口服液對A549細胞的體內外生長具有顯著抑制作用，其作用機制可能與抑制EGFR活性和下調Ras/Raf/MEK/ERK信號通路表達有關。

天佛參口服液；肺癌；A549細胞；增殖；裸鼠移植瘤模型；抗腫瘤

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率位居惡性腫瘤之首。近年來我國肺癌發病率呈逐漸上升趨勢，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的80%～85%[1-2]，其中30%～70%的患者確診時已處于晚期，5年生存率僅為17.7%[3]。因此大部分肺癌患者在確診時已經失去最佳手術時機，化療成為臨床晚期肺癌患者的主要治療手段，而晚期肺癌患者由于化療藥物的各種不良反應及繼發的耐藥情況極易導致化療失敗。天佛參口服液是一種已被批準生產的抗癌中成藥，由西洋參、蟾酥、天冬、倒卵葉五加、獼猴桃根、沙棘、土貝母、佛手8味中藥制成，具有扶正祛邪、養陰益氣、清熱解毒、消核散結的功效，主治惡性腫瘤所致的氣陰兩虛型及氣滯、血瘀、痰凝、毒聚等兼見癥候。臨床研究表明，天佛參口服液聯合化療藥治療NSCLC療效明顯，可以降低化療藥的不良反應，并提升晚期肺癌患者的生活質量，延長患者生存期[4-7]。本研究以人非小細胞肺癌A549細胞作為研究對象，探究天佛參口服液對其體內外增殖的作用及作用機制，以期為天佛參口服液用于治療/輔助治療肺癌及其抗腫瘤活性提供新的科學依據。

1 材料

1.1 細胞株

人非小細胞肺癌NCI-H2228細胞、人大細胞肺癌NCI-H1299細胞、A549細胞、人大細胞肺癌NCI-H460細胞、人非小細胞肺癌NCI-H23細胞、人肺癌腺癌NCI-H1792細胞和人肺退行性癌Calu-6細胞購自美國ATCC；人肺腺癌NCI-H1975細胞購自中國科學院上海生命科學研究院；人非小細胞肺腺癌NCI-H157細胞購自北京銀紫晶生物醫藥技術有限公司。

1.2 動物

SPF級雄性BALB/c裸鼠，6～8周齡，體質量18～20 g，購自北京大學醫學部實驗動物中心，動物許可證號SCXK（京）2016-0010。動物飼養于SPF動物房中，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，照明12 h/d。動物實驗經中國中醫科學院中藥研究所動物實驗控制與監督委員會批準（批準號2018-027）。

1.3 試劑

天佛參口服液（體外實驗生產批號1404281、體內實驗生產批號1805031）由常熟雷允上制藥有限公司生產，本品含西洋參不得少于0.35 mg/mL [以人參皂苷Rb1（C54H92O23）計]；DMEM培養基、RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清、胰酶購自美國Hyclone公司；Cell Titer-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司；磷酸化表皮生長因子受體（phosphorylated epidermal growth factor receptor，p-EGFR）抗體、EGFR抗體、p-b-Raf抗體、b-Raf抗體、磷酸化絲裂原細胞外信號調節激酶（phosphorylated mitogen extracellular signal-regulated kinase，p-MEK）抗體、MEK抗體、磷酸化細胞外調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）抗體、ERK抗體、β-actin抗體、二抗均購自美國CST公司；PE-Annexin V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；PBS溶液、RNAse A溶液（不含DNAse）購自北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（PI）購自美國Sigma公司。

1.4 儀器

1300系列A2生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Optec倒置顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；Envision多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；Guava EasyCyte流式細胞儀（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

體外實驗以天佛參口服液作為原液（濃度視為100%），每次使用前用無菌的3%蔗糖水溶液稀釋成需要的濃度，再經培養基稀釋成終濃度分別為10.000 00%、3.330 00%、1.110 00%、0.370 00%、0.123 00%、0.041 20%、0.013 70%、0.004 57% 8個濃度梯度進行細胞干預；動物實驗中，用蒸餾水將天佛參口服液原液稀釋成4.44、2.22倍的濃度分別用于低、高劑量組的動物給藥，現配現用。

2.2 細胞培養

各細胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度為70%時，進行傳代，取對數期、生長狀態良好的細胞進行實驗。

2.3 Cell Titer-Glo法檢測9種不同基因突變表型的肺癌細胞系活力

取處于對數生長期的細胞，經胰酶消化后接種于96孔板中，180 μL/孔，其中A549細胞接種密度為1×103/孔，NCI-H2228細胞接種密度為4×103/孔，其余細胞接種密度為2×103/孔，培養24 h。由于天佛參口服液的溶劑為3%蔗糖，因此用3%蔗糖水溶液將天佛參口服液進行稀釋，最高濃度取天佛參口服液原液的10%，并進行3倍梯度稀釋，每個濃度取20 μL加入到受試細胞中，3%蔗糖水溶液處理組為對照孔。處理72 h后，棄去培養基，加入25 μL Cell Titer-Glo?試劑，室溫振蕩混勻2 min，靜止10 min后，采用酶標儀讀取Luminescence熒光信號，使用GraphPad Prism 5.0軟件計算天佛參口服液對細胞增殖抑制的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。

2.4 流式細胞儀測定A549細胞周期分布

將A549細胞以2.5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃過夜培養。加入終濃度分別為0.030%、0.060%、0.125%、0.250%、0.500%的天佛參口服液，對照組加入3%蔗糖水溶液，處理24 h后用胰酶消化并收集細胞。收集的細胞樣品用預冷的PBS溶液洗滌2遍，用70%乙醇-PBS溶液吹散細胞，4 ℃固定過夜；用預冷的PBS溶液洗滌2遍，盡量去除殘留的乙醇；樣品用含50 μg/mL RNase-A和PI的染液進行染色，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期，通過FlowJo 3.0軟件進行數據分析。

2.5 流式細胞儀測定A549細胞凋亡情況

取對數生長期的A549細胞，以2.5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃過夜培養。加入終濃度分別為0.01%、0.10%、1.00%的天佛參口服液，對照組加入3%蔗糖水溶液，處理24 h后用胰酶消化并收集細胞。收集的細胞樣品用預冷的PBS溶液洗滌2遍，重懸于50 μL結合液中，每管加入2.5 μL PE- Annexin V試劑和2.5 μL 7-AAD試劑；對照組加入200 μL結合液，均分成4等份：1份不加任何染料，1份加入2.5 μL PE-Annexin V試劑，1份加入2.5 μL 7-AAD試劑，另1份加入2.5 μL PE-Annexin V試劑和2.5 μL 7-AAD試劑。溫和混勻，避光室溫孵育15 min，每份樣品加入150 μL結合液混勻，1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6 Western blotting法檢測A549細胞p-EGFR、EGFR、p-b-Raf、b-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK和ERK蛋白表達情況

取對數生長期的A549細胞，以5×105/孔接種于6孔板中，每組樣品設3個復孔，培養24 h。加入終濃度分別為0.001%、0.010%、0.100%的天佛參口服液，對照組加入3%蔗糖水溶液，分別處理0、10、20、30、45、60、90、120、240 min，用胰酶消化并收集細胞，收集的細胞樣品用預冷的PBS溶液清洗1次，加入細胞裂解液（1% NP-40、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、137 mmol/L NaCl、10%甘油、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑），冰上裂解15 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉，分別加入p-EGFR、EGFR、p-b-Raf、b-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗后，X光曝光顯影，采用Image J灰度分析軟件進行定量分析。

2.7 裸鼠移植瘤模型

BALB/c裸鼠適應性喂養7 d后，隨機分為模型組和天佛參口服液高、低劑量（4.50、2.25 mL/kg，分別相當于臨床劑量的1/2、1/4倍）組，每組6只。造模當天取對數生長期的A549細胞胰酶消化，細胞計數后以預冷的0.9%的氯化鈉溶液制備成5×106/mL細胞懸液備用。BALB/c裸鼠用75%乙醇消毒右側腋下皮膚，每只裸鼠右腋sc 0.2 mL A549細胞懸液[19]，造模后24 h開始給藥。以給藥當天為第1天，各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續48 d。第10天腫瘤開始陸續出現，于接種第20天（即給藥第19天）開始使用游標卡尺測量腫瘤長徑（mm）和短徑（mm），并計算腫瘤體積。每2～4天測1次，保持1周測2次。動物給藥第48天進行安樂死，剝離腫瘤稱定質量，計算抑瘤率。

腫瘤體積＝1/2×腫瘤長徑×腫瘤短徑2

抑瘤率＝(模型組平均瘤質量－給藥組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 天佛參口服液對不同肺癌細胞系增殖的抑制作用

如圖1和表1所示，天佛參口服液對9種不同基因突變表型的肺癌細胞系均存在不同程度的抑制作用，其中以N-Ras突變的NCI-H1299細胞和K-Ras突變的A549細胞對天佛參口服液最敏感，IC50分別為0.012%和0.013%，并且濃度超過0.3%的天佛參口服液能夠完全抑制并殺死9種不同基因突變表型的肺癌細胞系。

圖1 天佛參口服液對不同肺癌細胞增殖的抑制作用

表1 天佛參口服液對不同肺癌細胞增殖的抑制作用 (n =2)

3.2 天佛參口服液對A549細胞周期的影響

細胞增殖抑制與細胞周期分布密切相關。根據細胞增殖實驗結果，進一步檢測不同濃度天佛參口服液對其敏感細胞株A549的細胞周期分布影響，結果如圖2和表2所示，A549細胞經不同濃度天佛參口服液處理24 h后，與對照組比較，0.030%天佛參口服液組G0/G1期細胞顯著增加（＜0.01），而0.060%、0.125%、0.250%、0.50%天佛參口服液組G2/M期細胞顯著增加（＜0.01），表明低濃度的天佛參口服液能夠使A549細胞周期阻滯于G0/G1期，而濃度超過0.06%的天佛參口服液能夠明顯阻滯A549細胞于G2/M期，并成劑量相關性。

3.3 天佛參口服液對A549細胞凋亡的影響

細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。與對照組相比，腫瘤細胞存在明顯的抗凋亡現象。如圖3和表3所示，0.10%、1.00%天佛參口服液顯著誘導A549細胞發生晚期凋亡（＜0.05），表明高濃度的天佛參口服液能夠誘導A549細胞凋亡，并呈劑量相關性。

圖2 天佛參口服液對A549細胞周期的影響

表2 天佛參口服液對A549細胞周期分布的影響(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01，表3同

*<0.05**<0.01control group, same as table 3

圖3 天佛參口服液對A549細胞凋亡的影響

表3 天佛參口服液對A549細胞凋亡的影響(, n = 3)

3.4 天佛參口服液對A549細胞增殖相關蛋白表達的影響

為了進一步闡明TFS抗腫瘤的作用機制，檢測了天佛參口服液對增殖信號通路Ras/Raf/MEK/ ERK磷酸化水平的調節作用。首先觀察了0.5%天佛參口服液處理A549細胞不同時間點對該細胞信號轉導通路中EGFR、Raf、MEK、ERK蛋白磷酸化的作用，結果如圖4-A所示，0.5%天佛參口服液處理細胞A549 10 min時，MEK和ERK蛋白磷酸化水平開始降低；處理30 min時EGFR和b-Raf蛋白磷酸化水平開始降低，并于45 min時降低最明顯，天佛參口服液對Raf、MEK及ERK蛋白磷酸化的抑制作用一直持續2 h左右，隨后作用緩慢減弱，于作用4 h時MER和ERK的磷酸化水平開始上調。隨后觀察了不同濃度天佛參口服液處理A549細胞2 h對該細胞信號轉導通路的作用，結果如圖4-B所示，與對照組比較，不同濃度天佛參口服液作用2 h后均能夠不同程度地下調A549細胞中EGFR、Raf、MEK及ERK激酶結構域的磷酸化水平，并且存在一定的劑量相關性，且0.1%天佛參口服液抑制作用最顯著（＜0.05、0.01），表明天佛參口服液抑制A549細胞增殖的作用機制可能與調控EGFR活性及其下游信號通路Ras/Raf/MEK/ERK有關。

A-0.5%天佛參口服液作用不同時間對A549細胞增殖相關蛋白表達的影響 B-不同劑量天佛參口服液對A549細胞增殖相關蛋白表達的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 天佛參口服液對裸鼠移植瘤模型體內腫瘤生長的影響

如圖5和表4所示，給藥48 d期間，與模型組比較，天佛參口服液高、低劑量（4.50、2.25 mL/kg）對小鼠體質量均沒有明顯影響；天佛參口服液高、低劑量對裸鼠移植瘤模型腫瘤生長均具有一定的抑制作用，抑瘤率分別達到27.7%、36.7%；與模型組比較，天佛參口服液低劑量組小鼠瘤質量顯著降低（＜0.05）。

與模型組比較：*P＜0.05

表4 天佛參口服液對裸鼠移植瘤模型腫瘤抑制率的影響()

與模型組比較：*＜0.05

*<0.05model group

4 討論

天佛參口服液源于關中名醫李新民教授經過長期的臨床實踐，反復論證而總結出的抗癌經驗方。近年來，諸多藥理研究和臨床研究表明天佛參口服液對喉癌[8]、胃癌、肝癌、宮頸癌[9]等多種腫瘤細胞均具有良好的抑制作用，尤其臨床用于肺癌的治療起到很好的效果，能夠提高患者免疫功能，改善晚期肺癌患者的臨床癥狀和生活質量。此外，天佛參口服液與化療藥聯用可以減輕化療引起的不良反應，達到增效減毒效應，經臨床實踐證明為安全有效的治療非小細胞肺癌的中成藥[10]，但是其抑癌機制尚未闡明。本研究首先通過體外增殖實驗全面地觀察天佛參口服液對9種不同基因突變來源的肺癌細胞系（Calu-6、A549、NCI-H1299、NCI-H23、NCI-H460、NCI-H2228、NCI-H157、NCI-H1792、NCI-H1975）的生長抑制作用，篩選出天佛參口服液的敏感肺癌細胞系為A549和NCI-H1299細胞。合理的細胞有絲分裂及增殖是生物生存的基礎，而細胞周期失控導致細胞惡性增殖成為腫瘤，選取A549細胞進一步進行細胞周期和細胞凋亡檢測，發現低濃度的天佛參口服液（0.03%）能夠將A549細胞周期阻滯于G0/G1期，高濃度的天佛參口服液（0.06%～0.50%）可以阻滯其細胞周期于G2/M期，此外濃度超過0.1%的天佛參口服液可以明顯誘導A549細胞出現晚期凋亡，提示天佛參口服液可能通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡達到抗肺癌作用。

EGFR是一種具有酪氨酸酶活性的膜表面受體，在NSCLC中常發生突變，其突變后導致的酪氨酸激酶域過度激活是肺腫瘤發生的原因[11]，EGFR也是目前NSCLC靶向治療中最重要的靶點之一，EGFR能夠介導細胞的生長和凋亡，其主要機制是通過EGFR配體本身同源二聚化或異源二聚化啟動信號通路，從而引起機體內部的級聯反應。Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路為EGFR介導的下游信號通路中最重要且作用最廣泛的通路[12]，其主要涉及細胞的生長、增殖、分化、凋亡和轉移等生物學過程[13]。當Ras激活時，細胞質膜大量分泌并活化下游分子Raf激酶，并激發了一系列蛋白激酶激活和磷酸化，磷酸化的Raf和活化MEK可進一步激活ERK，活化的ERK從Ras-Raf-MEK-ERK復合體上分離，并轉移至細胞核內，在此發生磷酸化并激活細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、下調基因從而導致腫瘤細胞增殖，同時增強抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和髓細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）活性，減少腫瘤細胞的凋亡[14]。因此該通路的過度激活在NSCLC的發生、發展中發揮重要的作用[15]。Western blotting結果顯示，天佛參口服液能夠抑制EGFR活性，并下調其下游信號通路中Raf、MEK以及ERK蛋白的磷酸化水平，且處理細胞45 min時作用最強。由此推斷天佛參口服液中的有效成分能夠通過抑制EGFR活性，降低Ras/Raf/MEK/ERK信號通路中相關蛋白的磷酸化水平，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，從而發揮抑瘤效果。

目前，裸鼠移植瘤模型已被廣泛應用于抗肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和結腸癌等腫瘤藥物的篩選中[16-19]。課題組前期在Lewis肺癌小鼠移植瘤模型上，發現天佛參口服液劑量在2.25～4.50 mL/kg時抑瘤效果較好，為了避免雌性小鼠性周期對造模和藥效的影響，本研究采用雄性BALB/c裸鼠皮下接種A549細胞建立裸鼠移植瘤模型來評估天佛參口服液（2.25、4.50 mL/kg）對A549細胞的體內抗腫瘤活性，結果顯示低劑量（2.25 mL/kg）的天佛參口服液能夠抑制A549細胞移植瘤模型的腫瘤體內生長。

綜上，體內外實驗表明天佛參口服液對A549細胞具有抗腫瘤活性，可能通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡來抑制A549細胞增殖，作用機制主要與抑制EGFR的活性、下調Ras/Raf/MEK/ERK信號通路表達有關。本研究為天佛參口服液臨床用于抗腫瘤治療或輔助治療提供了理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Tianfoshen Oral Liquid on proliferation of A549 cellsand

ZHANG Dan-dan, ZHAI Yun-liang, JI Fang, ZHANG Ya-yun, XIA Yang, LI Quan, WANG Heng-bin

Lei Yun Shang Pharmaceutical Group Co., Ltd., Suzhou 215009, China

To investigate the effect and related mechanism of Tianfoshen Oral Liquid (天佛參口服液) on cell proliferation in A549 cells and lung cancer mice transplantable tumor in model animals.Cell Titer-Glo assay was used to detect the inhibitory effect of Tianfoshen Oral Liquid on proliferation of nine different gene mutation phenotypes of lung cancer cell lines; Flow cytometry was applied to determine the effect of Tianfoshen Oral Liquid on cell cycle and apoptosis of A549 cells; Western blotting was used to explore the effect of Tianfoshen Oral Liquid on expression of proliferation-related proteins in A549 cells. Nude mice were sc A549 cells to establish nude mice xenograft tumor model, the effect of Tianfoshen Oral Liquid on growth of subcutaneous xenograft tumors in mice was investigated.Tianfoshen Oral Liquid inhibited the proliferation of A549 cells, with dose-dependent; Tianfoshen Oral Liquid blocked the A549 cell cycle in G0/G1and G2/M phases (< 0.05, 0.01), and 1% Tianfoshen Oral Liquid significantly induced apoptosis of A549 cells (< 0.01); Tianfoshen Oral Liquid significantly inhibited epidermal growth factor receptor (EGFR), Raf, mitogen extracellular signal-regulated kinase (MEK) and extracellular regulated protein kinase (ERK) protein phosphorylation levels (< 0.05, 0.01), showing a dose-dependent. The results ofexperiments showed that 2.25 mL/kg Tianfoshen Oral Liquid had a significant inhibitory effect on tumor growth in nude mice transplanted tumor models (< 0.05).Tianfoshen Oral Liquid has a significant inhibitory effect on growth of A549 cellsand, and its mechanism may be related to the inhibition of EGFR activity and down-regulation of Ras/Raf/MEK/ERK signal pathway expression.

Tianfoshen Oral Liquid; lung cancer; A549 cells; proliferation; nude-mice transplanted tumor model; anti-cancer

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6568 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.015

2021-04-14

張丹丹（1988—），女，博士，主要從事中藥藥理毒理基礎研究。E-mail: zhangdandan@lys.cn

王恒斌（1972—），男，高級工程師，主要從事中藥新藥開發及上市后研究。E-mail: wanghengbin@lys.cn

#共同第一作者：翟云良（1988—），男，碩士，主要從事中藥藥理及臨床研究。E-mail: zhaiyunliang@lys.cn

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