黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肺組織自噬蛋白BNIP3表達的影響

康甲超，蒙潔，陳冬梅，王勇，吳萍民，王晶

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

衰老是人體必經的一個自然過程，其不僅在組織器官，而且在細胞水平也可引起機體功能的變化，大量研究表明衰老與細胞自噬密切相關[1-2]。細胞自噬是機體為了適應不同環境而做出的有效內部調節，適度的自噬可以有效延緩衰老、改善衰老相關疾病[3]；然而，自噬是一個降解過程，過度的自噬對機體有害，任何過度的自噬都可能導致細胞死亡[4-5]。黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益氣補中，延緩衰老的功效[6]，并且有研究發現黨參可以抑制腦組織細胞自噬水平以減輕腦缺血再灌注損傷[7]。前期課題組研究發現黨參對衰老肺組織具有保護作用，研究中通過對各組肺組織基因芯片分析，發現基因Bnip3在肺組織衰老后和高劑量黨參干預后均發生差異改變[8]。BNIP3是一種僅有BH3的自噬蛋白，既能誘導細胞自噬，又能誘導細胞死亡[9]。為了進一步了解自噬蛋白BNIP3對衰老肺組織的作用以及黨參的干預功效，本實驗采用D-半乳糖復制小鼠衰老模型，通過檢測各組小鼠肺組織中自噬蛋白BNIP3和基因Bnip3的表達量，以期發現黨參對衰老肺組織在自噬方面的保護機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠100只，雌雄各半，2月齡，體質量(18±2)g，甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(甘)2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物房，室溫20～25 ℃，自然光照，攝食和自由飲水。所有實驗程序和方案均按照甘肅中醫藥大學動物倫理委員會(編號：2017-106)的指導方針執行。

1.2 藥物

黨參，采自甘肅岷縣，經甘肅中醫藥大學中藥資源教研室杜弢教授鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過濾，濃縮成含原藥材0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱保存，黨參水提物每5 d制備1次。

1.3 主要試劑

D-半乳糖購于美國Sigma公司，批號：24895207，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用；引物均由Invitrogen公司提供；Trizol試劑購于Invitrogen公司，貨號15596-026；SYBR熒光染液購于美國應用生物系統公司，貨號4367659；快速定量RT試劑盒購于中國天根生化科技有限公司，貨號KR106-02；兔抗BNIP3抗體(1∶150)購于中國索萊寶公司，貨號K004134p；兔SP試劑盒(兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統)購于中杉金橋，貨號SP9001-6；DAB顯色試劑盒購于中杉金橋，貨號ZL1-9018-3。

1.4 主要儀器

透射電子顯微鏡JEM-1230，購于日本捷歐路科貿有限公司；離心機5415D，購于德國艾本德公司；PCR7500系統，購于美國應用生物系統公司；凝膠成像系統UVP I-D001，購于博奧生物集團有限公司；光學顯微鏡，購于日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 分組

將100只SPF級昆明種小鼠隨機分為正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。

2.2 造模及給藥

依照龔國清等人的造模方法造模[10]，采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液復制衰老模型，給藥劑量為每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g。造模的同時黨參低、中、高劑量組給予5、10、15 g/kg黨參溶液灌胃，灌胃體積為每日每只小鼠0.025 mL/g，正常對照組和衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃，以上造模連續42 d。

2.3 透射電子顯微鏡

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動物，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織沖洗干燥后切成約1～3 mm/片，然后將其放入預先冷卻的2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定過夜，用PBS沖洗3次，1%鋨酸染色，脫水，浸泡，包埋，聚合后將肺切成70 nm片狀，重新染色后觀察正常對照組、模型組和高劑量黨參組肺組織細胞超微結構的變化。

2.4 RT-PCR方法

采用Trizol試劑提取正常對照組、模型組和高劑量黨參組總RNA，mRNA定量檢測采用SYBR熒光染料法進行。采用兩端不同的引物進行逆轉錄，經逆轉后cDNA模板在上下游引物引發下進行定量PCR檢測，mRNA表達量均以GAPDH為內參基因，數據采用2-△△CT方法計算基因相對表達量。見表1。

表1 RT-PCR檢測Bnip3引物序列

2.5 免疫組織化學染色

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動物，注射量為0.004 mL/g，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織固定，制作成蠟塊。二甲苯脫蠟12～15 min，3%的過氧化氫浸泡10 min除去內源性過氧化氫酶，封閉血清后滴加一抗、二抗、顯色劑。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 肺組織超微結構觀察

正常對照組Ⅱ型肺泡上皮細胞結構正常，線粒體結構正常；模型組中大量線粒體腫脹，膜結構消失，線粒體結構破壞，Ⅱ型肺泡上皮細胞中的板層小體完全脫落；高劑量黨參組中未見異常改變，肺泡腔、板層小體和線粒體無明顯改變(見圖1)。

3.2 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

設計兩種不同引物檢測肺組織中基因Bnip3表達量，使用引物一檢測Bnip3相對表達量發現，Bnip3在衰老后肺組織中表達上調，在高劑量黨參干預后表達下調(見表2、圖2A)，使用引物二檢測Bnip3相對表達量發現，Bnip3在衰老后肺組織中表達上調，在高劑量黨參干預后表達下調(見表2、圖2B)差異具有統計學意義(P<0.01)。

3.3 免疫組織化學染色

圖像分析采用Image J軟件，分析各組小鼠肺組織免疫組織化學染色在高倍鏡下三個視野的BNIP3陽性率，結果用均數±標準差表示，與正常對照組相比，模型組BNIP3陽性率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，高劑量黨參組BNIP3陽性率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)(表3)。正常對照組中陽性細胞少見，低劑量黨參組陽性細胞多見，中劑量黨參組中陽性細胞少量，高劑量黨參組中陽性細胞少見，模型組陽性細胞多見，陽性率最高，染色結果最深(見圖3)。

注：圖中△所指為板層小體，→所指為腫脹破壞的線粒體。圖1 肺組織透射電鏡觀察

表2 RT-PCR不同引物序列檢測Bnip3相對表達量

注：A,Bnip3表達量(引物一);B,Bnip3表達量(引物二);與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01。圖2 RT-PCR方法檢測衰老后及高劑量黨參干預后肺組織中Bnip3相對表達量

注：圖中→所指為陽性細胞。圖3 各組小鼠肺組織免疫組化結果(×400)

表3 黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肺組織中蛋白BNIP3表達的影響

4 討論

細胞自噬是一把雙刃劍，研究顯示，肺組織細胞的過低自噬和過度自噬均可引起或加重肺損傷[11]。在本次研究中，模型組肺組織超微結構發生明顯異常改變，細胞結構被破壞，細胞膜受損，大量胞質外流，線粒體腫脹破壞；高劑量黨參干預后肺組織超微結構好轉，未見明顯異常。BNIP3定位于線粒體外膜，在細胞缺氧環境下其表達量明顯增多[12]，對凋亡和線粒體自噬至關重要[13]。BNIP3在細胞死亡和存活中的作用已被廣泛研究[14]，誘導BNIP3過表達可通過線粒體功能障礙促進大多數細胞類型的死亡[15]，2005年Lemasters[16]首次提出線粒體自噬的概念，主要指在氧化應激、衰老及能量限制等刺激下，細胞內的線粒體發生去極化損傷使線粒體被破壞。通過對模型組和高劑量黨參組超微結構的觀察，發現黨參具有保護衰老肺組織和肺細胞中線粒體的作用，其機制可能與黨參阻止細胞過度自噬有關。

研究表明BNIP3基因敲除導致細胞凋亡減少，而BNIP3基因過度表達則增加了凋亡細胞的數量[17]。本研究通過RT-PCR方法檢測小鼠衰老后和高劑量黨參干預后肺組織中Bnip3表達量，發現衰老后肺組織中Bnip3表達量明顯升高，高劑量黨參干預后明顯降低；通過免疫化學染色技術，觀察各組肺組織中BNIP3陽性率的變化，模型組中BNIP3陽性率最高，高劑量黨參組中BNIP3陽性率明顯下降，與RT-PCR結果一致，再次證明黨參能降低衰老肺組織中BNIP3的表達量，保護衰老肺細胞因BNIP3基因過度表達免受凋亡。

綜上所述，黨參能改善衰老小鼠肺組織的超微結構，保護肺細胞中線粒體免受破壞，黨參對衰老小鼠肺組織的保護作用可能是通過降低BNIP3的過度表達有關。本研究為黨參對細胞自噬影響的藥用開發提供了一定的理論依據。