濃香型白酒釀造環境中酵母的篩選及其組合發酵特性

劉 宇，管桂坤，萬自然，袁 寧，劉明坤，左 翔

（山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731）

濃香型白酒在窖內的發酵依賴于環境、大曲、窖泥中各種微生物的共同參與，經過微生物的代謝和復雜的生化反應形成了以己酸乙酯為主體復合香的香味物質，賦予濃香型白酒“窖香濃郁、綿甜爽冽、香味協調、尾凈味長”的特點。濃香型原酒中的香味成分主要來源于酯類物質，主要包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等，四大酯的含量及其量比關系決定了濃香型白酒的品質和風格[1]。近幾年，大多數酒企出現濃香型原酒中乙酸乙酯不同程度偏高的問題，造成己乙比失調或者嚴重失調，聞香香氣欠正、帶有青干氣、味短且平淡，嚴重影響了后期勾調，成為白酒行業亟待解決的重要問題。目前，濃香型白酒中乙酸乙酯的相關研究主要集中在從理論和實踐生產上探究引起濃香型原酒乙酸乙酯含量偏高的主要原因以及解決辦法[2-5]。

白酒的釀造屬于“多微共酵”的過程，涉及到復雜的微生物相互作用以及生理生化反應過程，常規的單菌培養并不能呈現出白酒實際生產中真實的微生物代謝情況。因此，組合發酵方式成為研究白酒釀造微生物功能的有力工具[6-7]。本研究從濃香型白酒釀造環境中分離篩選了3 株酵母，經分子生物學鑒定后進行了組合發酵特征研究，從微生物的角度解析了濃香型白酒中乙酸乙酯偏高的內在原因，這為解決白酒行業中己乙比失調的問題提供了新思路，有利于濃香型白酒的高質量發展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

微生物篩選樣品取自山東蘭陵美酒股份有限公司濃香型白酒生產車間大曲、釀酒工具、空氣，釀酒工具采用樣本無菌脫脂棉預濕法進行采樣，空氣樣本采用無菌脫脂棉鼓風附著法和自然沉降法采樣。采樣結束后將脫脂棉置于無菌自封袋中4 ℃冷藏儲存。

酵母篩選培養基選用WL 合成培養基，青島海博生物；青霉素，山東魯抗；酵母保藏培養基采用YPD 培養基；PCR 產物回收、純化、質粒的提取等DNA 操作試劑盒購自大連生物工程（大連）有限公司；酵母26S rDNA 序列鑒定委托上海生工生物工程有限公司進行；酵母發酵糖液為10°Bx高粱汁培養基；淀粉酶和糖化酶購自無錫雪梅。

儀器設備：美國伯樂PCR 儀，北京百晶電泳儀和凝膠成像分析儀，YXQ-LS-75SN 立式壓力蒸汽滅菌鍋，JHT-系列凈化工作臺，MJX-280S 智能霉菌培養箱，FLY-211C 恒溫振蕩培養箱，安捷倫7890A氣相色譜儀，上海譜元A-1502分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母的篩選

將采集的篩選樣品加入生理鹽水振蕩3 min，取上清液用無菌水將其稀釋至10-1～10-5等系列梯度，分別吸取200 μL 各樣本梯度稀釋菌液涂布于WL 合成培養基，30 ℃恒溫培養2～3 d 進行初篩。然后選取不同菌落形態的酵母，采用平板劃線法進行復篩。獲得酵母純培養后，接入YPD 培養基保藏備用。

1.2.2 酵母的分子生物學鑒定

以經NaOH 破壁提取的酵母DNA 為模板[8]，以26S rDNA-D1/D2區域的通用引物為擴增引物進行PCR 擴增，得到酵母26S rDNA-D1/D2 區域的基因，經純化后送至上海生工生物工程有限公司測序。將酵母的26S rDNA-D1/D2 基因序列測序結果通過在線數據庫BLAST 進行序列比對，比對結果用MEGA5.0 軟件進行同源性分析，并采用鄰位相連法構建系統發育樹。

1.2.3 酵母生長曲線的繪制

將酵母在無菌條件下接入YPD 液體培養基，30 ℃恒溫150 r/min 培養48 h，然后每隔一段時間取樣，以未接種酵母的液體培養基為空白對照，在600 nm 處測定其吸光度，測定值控制在0.1～0.9 之間。如果菌懸液太濃，可適當稀釋。最后，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制酵母的生長曲線。

1.2.4 發酵醪微量組分分析

量取25 mL 發酵醪于250 mL 錐形瓶中，加入無水乙醇100 mL 浸提15 min，旋渦振蕩5 min。然后將浸提液用雙層紗布過濾至500 mL 燒杯中，并用100 mL 去離子水分數次充分洗滌錐形瓶、燒杯、紗布，濾液與洗液全部倒入1000 mL 蒸餾瓶中，用100 mL 容量瓶接收餾出液（外用冰水浴），緩慢加熱蒸餾，當餾出液接近刻線時，取出容量瓶，調液溫20 ℃，用去離子水定容，混勻后用氣相色譜法[9]檢測微量組分。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的篩選及菌落形態

經過分離純化和菌落形態的初步鑒定共獲得3株酵母，分別命名為J1、J2和J3，其菌落形態特征如表1 所示。由3 株酵母菌株的形態特征可以初步判定：篩選得到的酵母形態特征差別較大，種屬的分類地位各不相同。

表1 濃香型白酒車間3株酵母菌株的菌落形態特征

2.2 酵母菌株的分子生物學鑒定

為了進一步確定J1、J2、J3 的種屬地位，對其進行了分子生物學鑒定。經測序表明，研究中J1、J2、J3 獲得26S rDNA-D1/D2 部分片段大小分別為621 bp、606 bp、625 bp。通過BLAST同源序列比對表明J1、J2、J3 基因分別與Debaryomyces hansenii（GenBank:KC848298.1）、Pichia fermentans（Gen-Bank:KM589468.1）、Naumovozyma castellii（Gen-Bank:KY108659.1）同源性最高。利用鄰接法構建系統進化樹（圖1），結合3 株酵母的形態學特征對其做進化樹聚類分析，最終將J1、J2、J3 分別鑒定為漢斯德巴氏酵母菌（D.hansenii，Dh）、發酵畢赤酵母（P.fermentans，Pf）、卡斯特瑙曼氏酵母（N.castellii，Nc）。

圖1 采用鄰接法構建3株酵母的系統發育樹

2.3 酵母的生長規律分析

采用分光光度法繪制3 株酵母的生長曲線（圖2），結果表明：3 株酵母遲緩期差別不大，在培養48 h 后均能達到穩定期；Dh 和Pf 生長速度較快，穩定期菌體濃度較大；Nc 生長速度一般，穩定期菌體濃度較低，進入衰亡期時間較早。

圖2 3株酵母的生長曲線

2.4 酵母的純種發酵規律分析

將培養好的Dh、Pf 和Nc 種子液按照1.0×105cfu/mL 接種于10 °Bx 高粱汁培養基中發酵，30 ℃恒溫靜置培養4 d 后得到3 株酵母的發酵醪微量組分。根據表2 可知，Pf 產乙酸乙酯能力明顯高于Dh 和Nc，Dh 產乙酸乙酯能力最低，Dh、Pf 和Nc產有機酸和醇類物質差別不明顯。

表2 3株酵母發酵醪中主要的微量組分對比

2.5 酵母的組合發酵規律解析

考慮到Pf 產乙酸乙酯與Dh、Nc 的差異性以及Dh、Pf 和Nc 生長的規律性設計了如表3 所示的酵母組合發酵試驗。表3 中1.0×105cfu/mL 為1 個比例單位，比如P10N 試驗中Pf 的發酵起始濃度控制為1.0×106cfu/mL，其他組合亦然。

將培養好的Pf、Nc 和Dh 種子液按照表3 中的比例關系接種于10 °Bx 高粱汁培養基中發酵，30 ℃恒溫靜置培養，期間取樣分析酵母的群體生長情況和發酵醪微量組分，結合圖3 和表4 得到了3株酵母的組合發酵規律。

表3 3株酵母的組合發酵試驗設計

在發酵初始階段（0～1 d），Pf 迅速生長起來，乙酸和乙酸乙酯同步積累；根據PN、PD、PND 組合發酵結果來看Pf 生長受Nc 和Dh 抑制明顯，進而影響到初始階段乙酸和乙酸乙酯的積累（圖3d、圖3e、圖3g），其中PND 組合乙酸乙酯的初始合成量減少80.18%；增加Pf 接種量后乙酸乙酯積累量明顯增加，其中P100ND 組合乙酸乙酯的初始合成量是PND 組合的3.40 倍；另外，Nc 和Dh 在此階段也迅速生長起來，結合3N、3D、ND 組發酵結果來看Nc和Dh的生長此階段都受到了不同程度的抑制。發酵中期（1～3 d），Pf 繼續生長繁殖，乙酸和乙酸乙酯的變化趨勢出現差別；根據PN、PD、PND 組合發酵結果來看Nc 和Dh 對Pf 生長的抑制作用逐漸減弱，乙酸乙酯積累持續增加（圖3d、圖3e、圖3g），其中PND 組合3 d 時乙酸乙酯的積累量與3P 組相當（占3P 組79.86%），乙酸的積累受多種因素影響規律性不明顯；增加Pf 接種量后乙酸乙酯積累量增加明顯，其中P100ND 組合3 d 時乙酸乙酯的積累量是PND 組合的2.12 倍；另外根據3N、3D、ND組發酵結果來看，Dh生長受Nc抑制很小。

圖3 3株酵母發酵醪中乙酸和乙酯乙酯的動態變化

發酵后期（3～4 d），由于營養物質匱乏等諸多不利因素Pf 生長緩慢或進入衰亡期，乙酸乙酯積累速度放緩，PN、P10N 和P100N 組合乙酸乙酯積累量增加明顯；根據PN、PD、PND 組合發酵結果來看Dh對Pf 后期積累乙酸乙酯影響明顯，Nc 對Pf 發酵后期影響較小，結合表4 群體生長情況推斷Dh對Pf 發酵后期屬于代謝物抑制；增加Pf 接種量后P10ND 和P100ND 乙酸乙酯積累量增加較小，其中P100ND組合發酵后期乙酸乙酯的積累量僅僅增加8.36 mg/L，Dh 對Pf 后期積累乙酸乙酯的抑制作用明顯。

表4 3株酵母發酵醪中群體生長情況(×107 cfu/mL)

3 結論

3.1 通過26S rDNA-D1/D2 同源比對構建系統發育樹結合形態學特征將濃香型白酒釀造環境中篩選出的3 株酵母鑒定為發酵畢赤酵母（P.fermentans）、卡斯特瑙曼氏酵母（N.castellii）和漢斯德巴氏酵母菌（D.hansenii）。

3.2 發酵畢赤酵母Pf是1株高產乙酸乙酯的酵母，漢斯德巴氏酵母菌Dh對Pf積累乙酸乙酯的抑制作用明顯高于卡斯特瑙曼氏酵母Nc 對Pf 的抑制作用，Dh 對Pf 發酵產乙酸乙酯屬于代謝物抑制；提高Pf接種量可以適當提高乙酸乙酯的積累水平。

3.3 通過群體生長情況發現Pf 和Dh 生長受Nc 的抑制作用很小，Nc 生長受Pf 和Dh 抑制作用明顯；結合酵母組合發酵確定了3 株酵母的種群關系，即Pf為優勢種群，Dh次之，Nc為劣勢種群。

3.4 濃香型白酒中乙酸乙酯偏高的內在原因是酵母的種群結構失調，造成畢赤酵母等高產乙酸乙酯的酵母種屬大量增殖，該屬酵母具有較強的種群生長優勢。

本研究從酵母組合發酵和種群關系的角度出發分析乙酸乙酯偏高的內在原因，還未涉及到濃香型白酒生產和發酵過程中微生物種群結構分析，有待于進一步的研究。