清香型小曲白酒生產中紅曲霉的分離及發酵特性研究

朱麗萍，楊 強，劉源才，張 龍，張 磊，陳申習

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

紅曲霉是藥食兩用微生物，發酵后可以代謝產生降血脂成分莫納可林K、降血壓成分γ-氨基丁酸，可用于保健食品及功能食品中。且紅曲霉在生長過程中能產生多種生物酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶等[1-2]，可以催化發酵底物的分解和多種代謝產物的生成，促進發酵質量的改善，故在釀酒行業中多有應用。如劉新宇[3]在汾酒的清香型大曲中篩選得到2 株酯化酶活較高的紅曲霉，通過培養條件優化酯化酶活達到2.46 U；馮曉山[4]在濃香型大曲中分離得到高產酯的紅曲霉，應用于西鳳小麥曲生產中，取得了較好的實驗效果；楊維建[5]從郎酒醬香型大曲中分離得到高溫紅曲霉，分析發現其在醬香型郎酒釀造中起到重要的作用。雖然各香型大曲中紅曲霉的相關研究報道較多，但在清香型小曲中尚無相關報道。由于清香型小曲中微生物研究較少，大量有益微生物類群至今未被解析[6]，使得人們一直對清香型小曲微生物認識存在一定誤區，認為其微生物菌群結構及作用不及大曲。經現代檢測技術發現，在清香型小曲白酒中風味物質不僅含量豐富，而且種類多樣，這決定了清香型小曲白酒具有清香純正、醇甜柔和、余味爽凈的獨特品質特點，受到越來越多年輕消費者的喜愛[7-10]。

鑒于紅曲霉對發酵質量具有明顯的改善作用，且在清香型小曲研究領域還屬于空白，為進一步闡明清香型小曲白酒微生物菌群信息，提升發酵質量，本研究從發酵源頭酒曲開始，以綠衣觀音土曲、糖化醅和酒醅為研究對象，采用經典分類方法，對其中的紅曲霉進行系統研究。首次從中分離鑒定出多株紅曲霉，并對其在釀酒環境的耐受性、發酵特性進行了研究，為解析清香型小曲白酒良好品質和升級發酵質量提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 分離樣品

綠衣觀音土曲由勁牌有限公司提供，糖化醅和發酵醅由勁牌有限公司毛鋪酒廠正常生產批次的班組提供。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養基干粉46.6 g，溶于1000 mL 蒸餾水，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，備用。

乙醇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養基干粉46.6 g，溶于一定體積蒸餾水，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，加入一定量的無水乙醇，pH 值自然，配制成不同濃度的乙醇-PDA培養基。

乳酸馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養基干粉46.6 g，溶于1000 mL 蒸餾水中，添加乳酸調節pH 值，配制成不同pH 值的乳酸-PDA 培養基，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，備用。

大米培養基：取一定量秈稻米，浸泡3 h 瀝干后，稱取50 g 瀝干后的大米分裝于250 mL 的三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，趁熱用手拍打三角瓶至米粒均勻不結塊，冷卻后備用。

麥芽汁培養基：稱取一定量麥芽提取物，加入900 mL 蒸餾水中，調節波美度為10°Bx，添加5 mL乳酸，以115 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，加入100 mL的無水乙醇。

1.1.3 儀器設備

104C ECLIPSE E200 顯微鏡，日本尼康有限公司；SF-CF-2A 超凈工作臺，鄭州南北儀器設備有限公司；WD-9413B 凝膠成像系統，北京六一電泳儀器廠；2720PCR 儀，賽默飛世爾科技公司；HH-S恒溫水浴鍋，上海索譜儀器有限公司；Neofuge 18R高速冷凍離心機，上海Heal Force 公司；721 型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離篩選及顯微形態觀察

稱取0.5 g酒曲樣品或1 g酒醅樣品于裝有100 mL麥芽汁培養基的250 mL 錐形瓶中，置于30 ℃培養2～4 d 富集紅曲霉，增殖液經適當稀釋，涂布分離于新的PDA 培養基上，挑選不同形態的菌落進行劃線分離，純化出的單菌落挑取小塊長有紅曲霉的培養基，于裝有1 mL 30%甘油溶液的甘油管中，放于-20 ℃下過夜后，置于-80 ℃保藏。

菌落的顯微形態觀察：將活化后的菌株接種到PDA 培養基中，取無菌蓋玻片，以傾斜約45°方式插入培養基中，每皿插入4～6片，30 ℃溫箱中倒置培養7 d，取蓋玻片在顯微鏡下觀察，觀察包括菌絲、分生孢子、閉囊殼和子囊孢子顏色及形態在內的顯微形態特征[11]，記錄并拍照。

1.2.2 分子生物學鑒定

真菌模板制備：使用土壤中微生物基因提取試劑盒提取紅曲霉的模板DNA。

PCR 反應體系為30 μL：PremixTaq（EX Taq-Version2.0）15 μL，DNA 模板2 μL，上游引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）0.5 μL、下游引 物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）0.5 μL，dd H2O 12 μL。

PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，循環35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，PCR產物送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結果與NCBI數據庫中已知序列進行BLAST比對。

1.2.3 耐受性試驗

（1）乙醇耐受性

將篩到的紅曲霉接種于9 個不同乙醇濃度（0%vol、4%vol、8%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21 %vol、23 %vol、25 %vol）的乙醇-PDA 培養基中，以30 ℃培養7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對乙醇耐受性情況。

（2）耐高溫試驗

將篩到的紅曲霉接種PDA 培養基中，置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的培養箱中培養7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對溫度耐受性情況。

（3）耐酸試驗

將篩到的紅曲霉接種不同pH 值（2.5、3、4、5、6、7）的乳酸-PDA 培養基中培養，以30 ℃培養7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對酸度的耐受性情況。

1.2.4 紅曲的制作

將菌株接種于PDA 平板上活化，30 ℃培養7 d后，加入10 mL 無菌蒸餾水洗孢子，洗出液在錐形瓶中用玻璃珠振搖打散約10 min，用3 層擦鏡紙過濾除去菌絲，采用血球計數板計數，取106個/mL 孢子液1 mL 接種于制備好的米飯培養基的三角瓶中，混勻，間隔24 h 以2 mL/瓶補加無菌水1 次，且連續補水3 d，在30 ℃下靜置發酵14 d，發酵期間觀察米粒，如有結塊現象，用手拍打三角瓶至米粒均勻不結塊。發酵完成后，將其于40 ℃下烘干，以磨粉機粉碎并過60 目篩，密封，于-20 ℃下避光保存，待用。

1.2.5 蛋白酶活的測定

稱取5 g（精確至0.01 g）紅曲樣品，加入50 mL乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH3），在40 ℃水浴中浸出30 min，離心取上清液為酶浸出液。準確吸取酶浸出液1 mL，注入10 mL 離心管中，在（40±0.2）℃水浴中預熱5 min，準確加入2%酪蛋白溶液1 mL，計時，保溫40 min，立刻加入2 mL 的0.4 mol/L 三氯乙酸，以沉淀多余的蛋白質，終止反應。15 min 后離心分離。準確吸取上層清液1 mL，注入試管中加入5 mL 的0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL 福林試劑，搖勻，在（40±0.2）℃水浴中加熱20 min顯色。

空白試液與試樣測定同時進行，離心管中先后注入酶浸出液1 mL，三氯乙酸2 mL，2 %酪蛋白1 mL。靜置15 min 后離心分離，之后操作均與試樣測定相同。

以空白試液為對照，用分光光度計于波長680 nm，10 mm比色皿測定其吸光度。

式中：X——樣品的酶活力，μg/g（μg/mL）；

A——樣品平行試驗的平均吸光度；

K——吸光常數（K=98.49實驗室測定值）；

50×4——試樣稀釋倍數；

10——反應時間10 min，以1 min計；

m——稱取試樣的質量。

1.2.6 糖化酶活的測定

稱取5 g（精確至0.01 g）紅曲樣品，加乙酸-乙酸鈉緩沖液6 mL，加蒸餾水至60 mL，攪拌均勻后放入35 ℃水浴鍋中；恒溫放置1 h（前30 min 勤攪拌，后30 min 靜止），離心取上清液作為糖化的酶液。在試管中，加入2%可溶性淀粉5 mL，于35 ℃水浴鍋中預熱3～5 min，加入上述酶液0.5 mL，準確反應20 min，立刻取出0.5 mL 反應液于預先吸有1.5 mL DNS 的試管中，開水煮沸15 min，冷卻后加10.5 mL 蒸餾水，搖勻，比色測定?？瞻子酶邷販缁蠲敢?。

式中：m1——空白樣吸光度OD1所對應的葡萄糖毫克數；

m2——試驗樣吸光度OD2所對應的葡萄糖毫克數；

3——min轉換成h。

1.2.7 紅曲酯化力測定

紅曲的酯化力測定參考QB/T 5188—2017《釀造紅曲》中酯化力測定方法[12]。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的分離

綠衣觀音土曲、糖化醅、發酵醅樣品經富集培養后，稀釋涂布于PDA 平板上，均有菌落長出，見圖1，挑選其單菌落在PDA 培養基上分離劃線純化。純化后的菌株，點接于PDA 平板中，觀察其菌落形態差異，見圖2；同時，使用插片法觀察其顯微形態差異，見圖3。通過菌落形態和顯微形態觀察獲得9 株形態不同的疑似紅曲霉菌株，依次命名為紅曲霉M1—M5、T1—T4。

圖1 待分離樣品中紅曲霉菌落形態

圖2 9株紅曲霉的單菌落形態

圖3 9株紅曲霉的顯微形態

2.1.2 分子生物學鑒定

使用試劑盒提取9 株紅曲霉的DNA，對其ITS基因序列進行擴增，PCR 產物送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序，測序結果與NCBI 數據庫中已知序列進行BLAST比對，結果見表1。

表1 9株紅曲霉的分子生物學鑒定結果

測序結果經BLAST 比對，結合菌株形態，M1—M3、T1—T4 鑒定為紫色紅曲霉（Monascus purpureus），M4—M5 為紅色紅曲霉（Monascus ruber）。

2.2 耐受性實驗

2.2.1 乙醇耐受性試驗

9 株紅曲霉接種于9 個不同乙醇濃度（0%vol、4 %vol、8%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21%vol、23%vol、25%vol）的乙醇-PDA 培養基中，在30 ℃培養7 d后，記錄其菌落直徑的大小，結果見圖4。

圖4 不同濃度乙醇對紅曲霉生長的影響

在紅曲霉對乙醇耐受性實驗中發現，紅曲霉的乙醇耐受性均較高，在21 %vol的乙醇濃度下均能生長，這可能是在發酵醅中能檢測出紅曲霉的原因。在23%vol乙醇濃度下，除T2、M4外，其余7株菌株均能生長。紅曲霉M1、T1和M3能在含25%vol乙醇的PDA 中生長，表現出對乙醇較高的耐受性。在不同乙醇濃度中，紅曲霉的生長表現出一定的規律，M2、T2、T4 隨乙醇濃度增高，菌落直徑隨之減小，表現出對高濃度乙醇較弱的耐受性。同時，也發現一個有趣的現象，M1、M3、M4、M5、T3在乙醇濃度為12%vol，T1在乙醇濃度為15%vol時出現拐點，即隨乙醇濃度增高，菌落直徑先減小后增大，后又不同程度下降，表現出對一定高濃度乙醇較好的耐受性。有研究表明，一定濃度（3%vol）的乙醇會刺激紅曲霉的生長，并產生大量的色素[13]，在本次發酵過程中，有部分菌株出現類似的現象，即在低乙醇濃度（0～8 %vol）和在拐點乙醇濃度下，平板菌落的顏色與其他濃度相比明顯較深。

2.2.2 溫度耐受性

把9 株紅曲霉接種于PDA 平板中，置于不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）的培養箱中培養7 d，記錄其菌落直徑的大小，結果見圖5。

圖5 不同溫度對紅曲霉生長的影響

在考察紅曲霉對溫度的耐受性分析中，發現9株菌株均能在45 ℃的條件下生長，其中紅曲霉M1、M2、T3 的菌落直徑較大，表現出對高溫較好的耐受性。紅曲霉M3—M5、T1—T4 在設定的溫度范圍內呈現出隨溫度增高菌落直徑減小的變化規律，表明高溫對其生長有一定消極影響。紅曲霉M1 和M2 在設定的溫度范圍內呈現出菌落直徑隨溫度先增大后減小的變化規律，在35 ℃時菌落直徑達到最大，說明35 ℃為其最適生長溫度。由于清香型小曲發酵過程溫度相對于其他香型大曲發酵溫度較低[14-16]，經過發酵環境長期的馴化，在綠衣觀音土曲中發現的紅曲霉最適溫度與小曲發酵溫度相符合。

2.2.3 酸度耐受性

9 株紅曲霉接種于6 個不同pH 值（2.5、3、4、5、6、7）的乳酸-PDA 培養基中，30 ℃培養7 d 后，記錄其菌落直徑的大小，其中pH 值為2.5、3 的培養基為液態，故僅記錄其生長情況，結果見圖6。

圖6 不同pH值對紅曲霉生長的影響

在考察紅曲霉對pH值的耐受性分析中，發現9株菌株在pH3 時均能良好生長，在pH2.5 時，不能生長，表明9 株菌株對酸最大耐受性在pH3 左右。9 株菌株在pH 值為4～5 時菌落直徑最大，表明其最適生長pH值為4～5，即在較酸環境中，有利于紅曲霉的生長。在酒醅發酵過程中微生物生長代謝產生各種酸類物質，使酒醅的酸度不斷增高，紅曲霉對酸的耐受性，使其能夠在其中較好生存。

2.3 紅曲發酵特性研究

對9 株紅曲霉制備的紅曲樣品進行蛋白酶活檢測，結果見圖7。由圖7 可看出，不同的紅曲，蛋白的分解利用能力相差很大，紅曲T4 的蛋白酶活最高，為104.83 U/g，紅曲M2 次之，為78.89 U/g，紅曲M3、T1 的酶活較低，小于20 U/g，可見紅曲霉同種不同株之間的差異性較大。而蛋白酶活影響白酒的口感和品質[17]，為應用提供了不同酶活菌株資源。

圖7 9種紅曲蛋白酶活

9份紅曲樣品的糖化酶活見圖8。由圖8 可知，分離的紅曲霉制備成紅曲后，均有一定的糖化酶活，可在發酵過程起到糖化的作用。但紅曲糖化酶活均不高，紅曲M2的糖化酶活最高，為9533.46 U/g·h。

圖8 9種紅曲糖化酶活

9 份紅曲樣品的酯化力見圖9，由圖9 可知，土曲中分離得到的紅曲霉制備成紅曲后酯化力差異顯著，紅曲T2 的酯化力最高，為7.49 mg/g·100 h，紅曲M1次之，M5的酯化力為0。

圖9 9株紅曲霉酯化力

3 結論

本研究采用培養組學首次從清香型小曲、糖化醅和酒醅中分離得到了9 株紅曲霉，結合形態學觀察和分子生物學鑒定，主要為紫色紅曲霉（M.purpureus）和紅色紅曲霉（M.ruber），與市場上紅曲產品中常用生產菌種相同，豐富了商業菌種的來源。使用固態平板模擬固態發酵過程，發現紅曲霉最適生長pH 值為4～5，可耐受的最低pH 值為3；對乙醇有較好的耐受性，菌株M1、T1 和M3 最高可耐受25 %vol 的乙醇，且部分菌株對較高濃度乙醇有嗜好性，這為在高酸和高乙醇的酒醅環境中生存提供了可能。在耐溫方面，9 株紅曲霉最適生長溫度為30～35 ℃，符合清香型小曲發酵的溫度特點。另外，把分離出的紅曲霉制備成紅曲后檢測了其蛋白酶活、糖化酶活和酯化力，結果發現同種紅曲霉不同菌株之間酶活差異性較大，其中蛋白酶活、糖化酶活和酯化力分別較高的紅曲霉為T4、M2 和T2，具有較好的應用價值。本研究首次對清香型小曲白酒生產中的紅曲霉進行研究，獲得了兩種主要紅曲霉種類，豐富了清香型小曲白酒的微生物信息，為闡明清香型小曲白酒良好品質物質基礎提供了科學依據，也為下步在白酒發酵以及其他傳統釀造食品中紅曲霉的應用提供菌株資源。