安琪小粬對清香型白酒固態發酵揮發性風味物質的影響

潘天全，程 偉，張 杰，李 娜，鞏子路，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽金種子集團有限公司檢測中心，安徽阜陽 236018）

中國白酒風味獨特，種類繁多，隨著釀酒工藝的不斷發展與創新，不同風格特征的白酒相繼問世。濃香型白酒在我國白酒工業中占有比例較大，又是三大基本香型之一。清香型白酒“醇厚爽洌，尾凈香長”，酒體純凈、邪雜味較少。芝麻香型白酒以其“優雅細膩、豐滿柔和及典型的芝麻焦香”等風格，逐漸受到消費者的青睞[1]。固態法小曲清香型白酒是中國蒸餾白酒的重要組成部分，以糧谷為主要釀造原料，小曲為糖化發酵劑，經蒸煮攤晾、培菌糖化、續糟發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，其出酒率高、發酵周期短，以乙酸乙酯為主體香，其風味特點是“清香純正、自然協調、醇甜柔和、后味爽凈”等[2]。根據目前已報道的文獻，白酒中能夠檢測出香味成分有300 多種，包括醇、酸、酯、內脂類、硫化物、縮醛類、呋喃類、吡嗪類等物質[3]。這些風味成分可以采用蒸餾萃取、頂空固相微萃取、超臨界流體萃取等方法提取，通常采用毛細管氣相色譜法、靜態頂空法氣相色譜法、動態頂空法氣相色譜法進行檢測，這些分析檢測白酒中香氣成分的方法各有優缺點[4-5]。酒醅中的醇、醛、酯等香味物質的檢測使用頂空-氣相色譜法操作極為簡便[6]。為考察安琪小粬對清香型白酒固態發酵揮發性風味物質的影響，采用GC-MS 分析等方法跟蹤檢測糧醅揮發性風味成分的變化及其培菌糖化效果等，并對比分析了酒醅揮發性風味成分變化及原酒品質等，以期為安琪小粬在清香型白酒釀造生產中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗樣品：材料取自于金種子酒業制酒車間生產的糧醅，企業生產的清香型小曲，湖北安琪酵母股份有限公司生產的安琪小粬，試驗所用試劑均為分析純。

儀器設備：安捷倫7820B 型氣相色譜儀、安捷倫氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，5975C+7890A，EI 源）、DT-1000 電子天平等；地下不銹鋼發酵窖池、發酵箱等（自制）；酒醅取樣器（自制）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

操作要點：（1）釀酒原料：破碎后的高粱，并添加適量的優質大米，無霉變，無蟲蛀等；（2）潤料：破碎后的高粱用溫水潤料并堆積20～24 h 后，拌入大米、清蒸后的稻殼、蒸酒后的糟醅等，混合均勻，上甑清蒸；（3）蒸糧：根據原料特性及蒸煮糊化效果，一般初蒸15～20 min，敞蓋燜水50～55 min 后，再復蒸30～40 min；（4）培菌糖化：待蒸熟的物料散冷至30 ℃左右接入安琪小粬（試驗組），或接入清香型小曲（對照組）；同時，拌入原料總質量1%～2%清蒸后的稻殼，并混合均勻，進行堆積培菌糖化，溫度達到30～33 ℃，培菌糖化24 h 左右，即可配糟入池（箱）密封發酵；（5）入池（箱）發酵：堆積培菌糖化后拌入原料總質量2～3 倍的新鮮糟醅，混合均勻后通風降溫至22～24 ℃，投入發酵池（箱）密封發酵15 d，蒸餾取酒。

1.2.2 安琪小粬的應用

試驗組：向蒸熟降溫后的糧醅中添加原料總質量1.0 %的安琪小粬。對照組：向蒸熟降溫后的糧醅中添加原料總質量1.0%的清香型小曲。試驗組與對照組的培菌糖化及入池發酵工藝均相同。

1.2.3 分析檢測方法

1.2.3.1 培菌糖化糧醅及發酵酒醅的取樣方法

清香型白酒培菌糖化1 d，然后入池發酵周期為15 d，對加曲堆積前糧醅、加曲培菌糖化后糧醅、發酵結束后酒醅等分別進行取樣。采用對角線上取兩角和中心三個取樣點的樣品取樣，每點再分別取上層、中層、底層三個取樣點，樣品取回后混合均勻并及時進行分析處理。

1.2.3.2 糧醅培菌糖化前后理化指標檢測[7]

水分檢測：烘干法；酸度檢測：超純水浸泡，酸堿滴定法；淀粉與還原糖檢測：斐林試劑法。堆積過程中分別取糧醅50 g，加入100 mL 的無水乙醇浸泡24 h，取濾液分別采用酸堿滴定法檢測總酸含量、蒸餾-皂化法檢測總酯含量。

1.2.3.3 培菌糖化糧醅及發酵酒醅樣品的前處理方法

準確稱取15 g 培菌糖化糧醅（發酵酒醅）放入300 mL 的三角瓶中，用量筒準確量取150 mL 蒸餾水倒入三角瓶中，搖勻后進行蒸餾處理，用量筒準確收集前蒸餾液100mL 備用，將100 mL 的收集的蒸餾液采用二氯甲烷液對酒樣進行萃取，V（二氯甲烷）∶V（酒樣）=1∶1，重復3次萃取，經中低溫加熱并抽真空除去液體中的二氯甲烷，使樣液濃縮至5倍進行GC-MS檢測分析。

1.2.3.4 揮發性風味物質的GC-MS分析

GC-MS 分析條件，色譜柱：安捷倫DB-5MS 石英毛細管柱，30 m×0.25 mm(i.d.)，膜厚0.25 μm；進樣口溫度：200 ℃；色譜-質譜接口溫度：280 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999 %，流速：1 mL/min；進樣方式：不分流；進樣體積：1 μL；電離方式：EI；溶劑延遲：3 min。程序升溫：。揮發性風味物質的GC-MS 分析：采用質譜計算機自帶的NIST數據庫定性，各香氣物質組分的質譜經計算機譜庫檢索，再結合相關報道文獻解析譜圖，確定香氣物質種類，進行定性分析；通過將各香氣物質組分峰面積含量除以所有測得香氣物質峰面積含量總和，初步得出風味化合物的相對含量，進行半定量分析。

1.2.3.5 原酒的常規理化及氣相色譜檢測

原酒的理化分析，分別采用酸堿滴定法檢測總酸含量、蒸餾-皂化法檢測總酯含量。氣相色譜法檢測原酒四大酯含量，GC 分析條件：配有氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀，LZP-930白酒分析專用柱，氫氣流速40 mL/min、氮氣流速30 mL/min、空氣流速400 mL/min，程序升溫60 ℃，進 樣器溫度200 ℃，檢測器溫度220 ℃。

1.2.3.6 原酒酒樣的品評分析

原酒綜合樣由評酒員以“暗評”的方式進行人工感官品評分析。

2 結果與分析

2.1 小曲的應用工藝分析

2.1.1 小曲的制備

小曲是使用米粉、米糠或麩皮，有的添加一些中草藥，或者少量白土（觀音土），再接入種曲，加入適量水制成坯，在合適的溫度和濕度下培養而成。因其曲塊體積較小，習慣上稱為小曲[8]。金種子小曲的制作工藝為麩皮、稻殼2.5%各配料混合均勻，至少翻拌2次以上。加占質量60%～80%的水分，將原料翻拌均勻，采用生料制曲。添加根霉曲、生香干酵母和活性干酵母（或釀酒曲）等，加入適量溫水28～35 ℃進行活化20～30 min，翻拌均勻后入室培養。冬季小曲曲坯表層可加蓋草簾，夏季表層可加蓋紗布防止雜菌感染，同時防止水分揮發快。曲坯入室培養5 d 左右即可出室，40 ℃通風干燥或晾曬粉碎后使用。入室培養第2 天根據小曲升溫情況進行翻曲[9]。

2.1.2 小曲及其生產應用

小曲的生產工藝決定著小曲的質量標準，制備傳統小曲通常采用自然接種培養而成，造成了所制得的小曲中除了含有根霉菌、酵母等大量有益菌，還含有各種雜菌，如乳酸菌、芽孢桿菌等。由于傳統制曲工藝及設備的開放性，導致小曲中有益微生物種群不受人為控制，導致出酒率下降，酒質也不穩定[10]。安琪酵母公司生產的小粬所采用的工藝為液固培養法，斜面菌種經三級純種液態擴大培養，固態通風培養，快速低溫干燥等制備，以麩皮等農副產品為載體；粉末狀至不規則顆粒狀，顏色近似麥麩，色質均勻一致，無雜色，無霉雜氣味；成品水分≤10%，陰涼干燥處保存保質期為12個月。清香型白酒具有用曲量小、發酵周期短、出酒率高、生產設備簡易、成本低廉、適合于機械化生產等工藝特點；傳統小曲生產為自然接種，曲中不僅含有根霉菌和酵母菌，還含有其他雜菌，會對清香型白酒風味造成很大的影響。本研究主要分析安琪小粬對清香型白酒固態發酵揮發性風味物質的影響，并設置對照組，在實際生產中驗證安琪小粬與其他小曲對清香型白酒的糧醅培菌糖化及固態發酵風味的影響。

2.1.3 小曲清香型白酒的釀造生產工藝

小曲清香型白酒以糧谷為主要釀造原料，小曲為糖化發酵劑，經蒸煮培菌、續糟發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，其出酒率高、發酵周期短，具有“醇香清雅、糟香突出、回味協調、余味清爽”等風格特點。小曲在釀酒過程中起糖化和發酵的雙重作用，其主要依賴于小曲中含有豐富的釀酒微生物及其代謝酶類，主要包括酵母菌、霉菌、細菌和少量放線菌等，其中，在固態發酵過程中起主要作用的是霉菌和酵母菌[11]。有研究表明[12-13]，南洋混合酵母1308和K 氏酵母的發酵力很強，速度快，能耐22°Bx 糖度和12 %的酒精體積分數，并能耐較高的發酵溫度，pH 值為2.5～3 時生長良好，最適生長溫度為33 ℃；根霉菌Q303 糖化發酵率較高，而且產酸低，最適生長溫度為30～33 ℃，酶生成的溫度比生長溫度略高，最適產酶33～35 ℃。

小曲清香型白酒的釀造生產工藝：潤糧后拌稻殼蒸煮糊化，攤晾加入小曲，并控制好糧醅的含水量，糧醅培菌糖化溫度達到30～33 ℃，時間在24 h左右，即可配糟入池（箱）密封發酵。糧醅堆積培菌糖化后拌入原料總質量25 %左右的新鮮糟醅，混合均勻后通風降溫至22～24 ℃，再投入發酵池（箱）密封發酵15 d，即可出池（箱）蒸餾取酒。糧醅入池（箱）發酵過程中，應及時檢查發酵容器的密封性，并觀察發酵溫度變化，或采用發酵間集中放置發酵箱并控制溫度等方式實現發酵溫度的控制。

2.2 糧醅培菌糖化效果及其揮發性風味成分分析

2.2.1 糧醅培菌糖化效果比較

小曲清香型白酒的釀造生產以高粱為為主要原料，小曲為糖化發酵劑，采用堆積培菌糖化工藝。其使用的小曲為接種純種根霉、純種酵母菌的純種小曲，這些微生物具有邊生長邊糖化邊發酵等作用。在淀粉向還原糖轉化過程，小曲可增加糧醅的甜香與酒香，形成獨特的復合香。由表1 可知，糧醅培菌糖化結束，其淀粉含量具有所下降，還原糖含量、酸度、水分含量均有所增加，表明在堆積過程中微生物已經開始進行糖化作用；在堆積過程中水分和酸度都有所增加，而還原糖和淀粉等碳源則被消耗，這與發酵過程中微生物的擴大培養及其代謝有關；試驗組糧醅培菌糖化后的還原糖和酸度等理化指標均比對照組高，還原糖含量比對照組高25.9 %，淀粉消耗量比對照組高6.95 %，培菌糖化后的糧醅聞香優于對照組；因此，可以推斷安琪小粬相較于其他小曲在培菌糖化過程中微生物（根霉菌、酵母菌等）的繁殖和代謝能力較快，其培菌糖化效果較好。

表1 培菌糖化前后糧醅的主要理化指標檢測結果

2.2.2 糧醅培菌糖化前后揮發性風味成分分析

培菌糖化后的糧醅采用DB-FFAP 色譜柱進行GC-MS 分析，由圖1 可知，應用GC-MS 技術分析糧醅培菌糖化后試驗組的色譜峰比對照組的色譜峰要多，表明試驗組糧醅中揮發性風味成分的種類較豐富。由表2 可以看出，試驗組或對照組糧醅堆積后的揮發性風味成分都比堆積前要多，表明糧醅在培菌糖化前期所接種的微生物代謝活動較弱，糧醅在培菌糖化過程中，所接種的微生物代謝活動逐漸增強促進了風味物質的生成。試驗組中總共檢測到21 種香味風味物質，其中酯類物質7 種，醇類物質5 種，酸類物質5 種，酚類物質2 種，醛類物質1種，酮類物質1 種；對照組中總共檢測到16 種香味風味物質，其中酯類物質7 種，醇類物質3 種，酸類物質4 種，醛類物質1 種，酮類物質1 種；糧醅培菌糖化前含酯類物質7 種，酸類物質3 種，醛類物質1種，酮類物質1種。

表2 培菌糖化前后試驗組與對照組糧醅的GC-MS揮發性風味成分分析結果

圖1 培菌糖化后糧醅的GC-MS揮發性風味成分分析的總離子流譜圖

醇類(一元醇、多元醇和芳香醇)是糖、氨基酸等成分在霉菌、酵母菌、細菌等微生物的作用下生成的。高級醇主要是由酵母菌在非正常代謝狀態下脫去氨基酸中的氨再經脫羧酶脫羧生成[14]。培菌糖化前糧醅香味物質中無醇類物質，試驗組與對照組在培菌糖化后都產生幾類醇類物質，且試驗組培菌糖化后所產醇類物質的種類要比對照組多，可以推斷出在培菌糖化的過程中，某些酵母菌、霉菌等微生物將葡萄糖發酵產生酒精，生成醇類物質，試驗組中微生物發酵能力要強于對照組。酚類化合物來自小麥或制麥麩曲過程中由微生物生成，或在制麥麩曲時形成中間產物，再由酵母菌或細菌發酵而生成，并在發酵過程中相互進行轉化。試驗組在培菌糖化后產生了鄰苯二酚和4-乙烯基愈瘡木酚兩種酚類物質，對照組與糖化培菌前糧醅中都沒有出酚類物質，可以推斷酚類物質的中間物質可能來源于試驗組中的小曲，在培菌糖化過程中再由酵母菌或細菌發酵而生成。

2.3 發酵結束后酒醅的揮發性風味成分分析

發酵結束后酒醅采用DB-FFAP 色譜柱進行GC-MS 分析，其總離子流譜圖見圖2 可知，應用GC-MS 技術分析酒醅發酵結束后試驗組的色譜峰比對照組的色譜峰要多，表明試驗組酒醅中揮發性風味成分的種類較豐富。由表3 可知，試驗組中總共檢測到47 種香味風味物質，其中酯類物質26 種，醇類物質10 種，酸類物質6 種，醛酮類物質3 種，酚類物質1 種，其他類物質1種；對照組中總共檢測到38 種香味風味物質，其中酯類物質20 種，醇類物質6種，酸類物質7種，醛酮類物質3種，其他1種。

圖2 發酵結束后酒醅的GC-MS揮發性風味成分分析的總離子流譜圖

酯類化合物是構成小曲清香型白酒揮發性香氣的重要物質，中國白酒的整體香氣以酯香為主[15]，而世界上其他蒸餾酒則以醇香為主，這是我國白酒的一大特征。酯類化合物對中國白酒的主體香型及風格等感官特征有非常重要的影響[16]，主要以乙酯的形式存在，它們賦予中國白酒水果香、花香的感官特征。從表3 中可以看出，試驗組和對照組中酯類物質絕大部分以乙酯的形式存在，都含有小曲清香特征性香味物質乙酸乙酯和乳酸乙酯等風味成分。試驗組中的酯類物質種類要比對照組中多，酒醅中來源于釀酒用曲及環境中的枯草芽孢桿菌、漢遜酵母、假絲酵母等微生物均有較強的產酯能力，也有少部分來源是通過酯化反應[17]；可以推斷出，在發酵過程中試驗組這類微生物相較于對照組代謝要強。在試驗組中檢測到的丁二酸二乙酯，丁二酸二乙酯是清香型小曲酒酯類組分中較為重要的成分，其本身具有微弱的清香果實氣味，香氣閾值很低，沸點很高。雖然丁二酸二乙酯在酒體中的含量甚少，但它與β-苯乙醇相互作用，賦于清香型小曲酒香氣以“甜底”樣愉快的氣味，同時又使其香氣持久[18]。

在清香型白酒中的醇類物質是僅次于酯類物質的重要香味揮發性物質，其可使酒體濃厚豐滿，同時也是形成酯類化合物的前驅物質。醇類化合物主要來源于酵母在有氧環境下利用糖，在無氧條件下利用氨基酸產生，少量的醇來源于酵母降解相應的醛，在酒體風味中能起到助香的作用[19]。從表3 可知，試驗組中的醇類物質要比對照組多，可以推斷出在培菌糖化及發酵過程中試驗組中的酵母菌繁殖及代謝能力要比對照組強。酸類化合物具有維持酯類香氣、平衡酒味、協調香氣的作用[20]。從表3 還可看出，試驗組與對照組中的酸類物質種類差別不大。

表3 發酵結束后酒醅的GC-MS揮發性風味成分分析結果

從表3 中可以看出，試驗組與對照組中的醛酮類物質種類差別不大，較為特別的為酚類物質，試驗組中含有1 種即酚類物質4-乙烯基愈瘡木酚，對照組中沒有酚類物質。4-乙烯基愈瘡木酚系無色或淡黃色油狀液體，呈發酵香氣，略帶甜味，微帶酚的氣息，是決定酒類、醬油、茶葉、咖啡、干酪等食品品位及質量的一個主要香味成分[21]。從表2中可以看出，試驗組中含有的酚類物質有4-乙烯基愈瘡木酚，而對照組不含有酚類物質，可以進一步推斷出該酚類物質的中間物質可能來源于試驗組中的小曲，在培菌糖化過程中再由酵母菌或細菌等釀酒微生物發酵代謝而生成。

2.4 可揮發性風味成分的比較分析、原酒酒樣的常規理化分析及感官品評

2.4.1 可揮發性風味成分的比較分析

依據試驗組與對照組糧醅及酒醅風味物質成分分析結果（表2、表3），把風味物質分類后每類的數量繪制風味物質雷達圖。本研究將試驗組與對照組培菌糖化糧醅和發酵結束酒醅風味物質分別分為酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、其他類進行分析，建立了雷達圖，其風味物質成分比較直觀而清晰。從圖3（a）可以直觀的看出，試驗組培菌糖化糧醅中風味物質醇類物質、酸類物質、酚類物質的種類多，其他幾類物質相近；從圖3（b）可以直觀的看出，試驗組入池發酵后酒醅的風味物質明顯多于對照組。通過比較分析認為，使用安琪小粬的試驗組糧醅在培菌糖化及入池發酵過程中微生物的繁殖及代謝能力、產風味物質等方面均明顯優于對照組。

圖3 堆積糖化后糧醅與發酵結束后酒醅的風味物質雷達圖

2.4.2 原酒酒樣的常規理化分析及感官品評

從圖4 中可以看出，試驗組原酒中的總酸、總酯含量要高于對照組，可能與培菌糖化、入池發酵過程中微生物的代謝能力有關；目前普遍認為，清香型白酒中乙酸乙酯含量要大于乳酸乙酯的含量，其比例一般在1.4∶1～1.8∶1 較為適宜[22]。試驗組酒中的乙酸乙酯含量高于乳酸乙酯含量，乙乳比為1.77，其乙乳比相對較協調，主體香突出；對照組中的乳酸乙酯高于乙酸乙酯，乙乳比為0.40，其乳酸乙酯含量相對較高，可能與堆積、入池發酵等過程中放線菌、乳酸菌等微生物的繁殖代謝有關[23]。有研究表明，乳酸乙酯含量過高，可使酒體主體香不足，放香沉悶，后味不干凈[1]。試驗組酒中甲醇和正丙醇與對照組相差不大。應用安琪小粬所釀造生產的清香型原酒的感官品評意見為：“無色、清亮透明，無懸浮物，無沉淀，并具有以乙酸乙酯為主體的協調復合香氣，清香純正突出，入口微甜且甜味持久，香味悠長，落口干爽，回味怡暢。”應用其他小曲所釀造生產的清香型原酒的感官品評意見為：“無色、清亮透明，無懸浮物，無沉淀，并具有乙酸乙酯的主體香氣，清香純正，入口微甜，香味悠長，落口干爽，微有苦味。”

圖4 清香型原酒的常規理化對比分析

3 討論

白酒香型分類的影響因素主要包括用曲、工藝、發酵容器、風味物質等因素，根據風味物質的種類和含量差異確定不同香型，酯、醇、醛、酸等是其中最為重要的成分。小曲清香型白酒風味物質的形成主要分為兩個過程，一是糖化培菌過程，二是入池發酵過程。小曲在釀酒過程中起糖化和發酵的雙重作用，其主要依賴于它所含的豐富的釀酒微生物及其代謝酶類[24]。

采用GC-MS分析等方法跟蹤檢測糧醅揮發性風味成分的變化及其培菌糖化效果等，并對比分析了酒醅揮發性風味成分變化及原酒品質等。結果表明，在小曲清香型白酒原釀造生產工藝的基礎上使用安琪小粬，與對照組相比，試驗組糧醅培菌糖化后還原糖和酸度等理化指標均比對照組高，還原糖含量比對照組高25.9%，淀粉消耗量比對照組高6.95 %，培菌糖化后的糧醅聞香優于對照組；糧醅培菌糖化后揮發性風味成分的種類有所增加，尤其是酸類和醇類物質增加明顯；發酵結束后試驗組酒醅中的酯類和醇類物質的種類要多于對照組；試驗組中還檢測到丁二酸二乙酯和4-乙烯基愈瘡木酚（同時存在于試驗組糖化培菌的糧醅中）等，其中丁二酸二乙酯與β-苯乙醇相互作用，賦于清香型小曲酒香氣以“甜底”樣愉快的氣味，同時又使香氣持久；4-乙烯基愈瘡木酚是決定白酒質量的重要香味物質。試驗組原酒中的總酸總酯含量高于對照組，乙酸乙酯與乳酸乙酯比例較協調，試驗組原酒具有以乙酸乙酯為主體的協調復合香氣，清香純正突出，品質較好。