紅曲米培養工藝的優化研究

羅 莉，黃啟林，譚愛華，李方橋，孫 智

(1.湖北三峽職業技術學院農學院，湖北宜昌 443003；2.宜昌市裕禾菌業有限公司，湖北宜昌 443003)

紅曲霉是中國傳統食品發酵中重要的微生物，尤其是在傳統發酵領域和食品配料領域有著非常廣泛的應用。首先紅曲霉可以產生諸如糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶制劑，因此可以被應用于釀造、蛋白制品發酵等領域，作為原料降解、風味物質合成等多用途[1-2]。另外紅曲霉的兩大類次級代謝產物也被廣泛的應用，紅曲色素是目前使用歷史最長、應用體量最大、使用范圍最為廣泛的一類紅曲霉代謝產物，其應用已有上千年歷史，獨特的天然色素屬性一直受到食品行業青睞[3]。另一大類紅曲霉次級代謝產物是近幾年研究比較多的健康功能因子，如具有降血脂功能的莫納克林K 以及具有調節身體功能的γ-氨基丁酸類[4-5]。紅曲霉健康功能因子在亞洲有較早的認知和應用歷史，近些年也正逐步被歐美國家接受[6]。

目前國內和紅曲相關的國家標準共有4 個[7]，其中真正和紅曲霉相關的為GB 1886.19—2015《食品添加劑紅曲米》，其他都與紅曲色素相關。作為紅曲米生產單位，在國標限制范圍內，紅曲霉只能采用大米作為培養原料，所以紅曲霉的培養至關重要[8]。本研究以工業紅曲米生產為背景，探索色素型紅曲霉工業生產碳源、氮源，優化培養工藝，以期為紅曲霉的工業化生產原材料選擇做一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

菌種：紅曲霉Q，實驗室菌種。

原材料：葡萄糖、秈米、黃豆餅粉、玉米粉、玉米淀粉、米粉均采購自宜昌當地農貿市場。

試劑及耗材：酵母浸出物FN502，安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，硝酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

菌種斜面培養基（加強型PDA 培養基）：PDA培養基（g/L）：去皮馬鈴薯200，葡萄糖18，硫酸鎂5，磷酸二氫鉀5，瓊脂粉20。

液體種培養基（g/L）：碳源30（葡萄糖、蔗糖、淀粉、米粉、玉米粉、固態麥精）、氮源3（酵母浸出物、硝酸鈉、蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、氯化銨）、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.5。

1.1.3 儀器設備

ZXMP-A1430 恒溫恒濕培養箱；BSC-1300ⅡB2 無菌操作臺UV5200 分光光度計；ZQZY-85CN恒溫搖床。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗工藝

本試驗采用工藝流程：斜面菌株→茄子瓶（孢子懸濁液）→液體一級種→米飯（接種）→淺盤→翻料→培養

1.2.2 孢子懸濁液制備

茄子瓶中，采用紅曲霉菌種斜面培養基制備，劃線接種。在33 ℃條件下培養5～7 d，后采用60 mL無菌水洗脫，備用。

1.2.3 一級種子制備

將1.2.2 中的孢子懸濁液按照培養體積的3 %進行添加，在搖床200 r/min，33 ℃條件下，培養48 h后檢測色價并備用。

在碳源考察中，氮源采用酵母浸出物，當完成碳源考察后，固定效果最佳碳源，考察氮源。

1.2.4 培養及檢測

將秈米浸泡12 h 后，瀝干水分，上汽蒸30 min后，攤晾。將培養好的種子液用無菌酸化水pH3.5稀釋5 倍，分別按照15%接種米飯攪拌均勻，33 ℃培養，每天觀察水分含量進行翻料補水，米飯維持水分40%～45%，培養10 d 后，50 ℃慢速干燥、粉碎80～100 目、檢測色價。檢測方法參照GB 1886.19—2015《食品安全國家標準食品添加劑紅曲米》進行。

2 結果與分析

2.1 不同碳源的種子液色價發酵結果

在不同碳源條件下，種子液發酵48 h 后色價出現了顯著的變化，如圖1 所示，在幾種碳源條件下，發現單糖和二糖類在其中對紅曲霉色素的代謝沒有顯著促進作用，另外還有一個明顯的差異，就是在淀粉上面，玉米淀粉與米粉都顯示出了非常好的效果，在這點上何冬萍等[9]采用葛根粉在液態紅曲霉培養中，發現葛根粉與米粉的差異不大，說明此類淀粉都可以很好的促進紅曲霉色素代謝積累。整體效果上，玉米粉與玉米淀粉的差異，我們認為主要在顆粒度上有差異，導致實際培養體系中菌體接觸面以及溶解性都會影響到紅曲霉后續的產色素能力。鑒于玉米淀粉與米粉效果接近，考慮到工業實際生產應用成本因素，后續對氮源的考察采用玉米淀粉作為固定碳源。

圖1 不同碳源條件下發酵48 h色價變化

2.2 不同氮源的種子液色價發酵結果

圖2 的結果是在以玉米淀粉為碳源條件下，對氮源進行了考察，為了避免上面的影響，我們將碳源減少為之前比例的30 %進行實驗，發現有如下特點。在碳源減少條件下，酵母浸出物在發酵過程中對色素的積累的影響是最低的，而無機氮，尤其是硝酸氮的表現是最佳的。這點與相關研究是吻合的[10]，無機氮在紅曲霉色素積累方面更有優勢，另外，在一些文獻報道里面，銨鹽在生物量上有一定的優勢，在本次研究中，沒有以生物量作為核心指標，而是將色價作為評價指標，本次研究中顯示硝酸鈉對于紅曲霉色素的積累有促進作用。

圖2 不同氮源條件下發酵48 h色價變化

2.3 碳源氮源配比研究

在上面兩個實驗的基礎上，由于3%的碳源已顯示出比較好的效果，后面我們固定碳源水平，對硝酸鈉的添加量做了梯度添加，并將培養好的種子液接入米飯中培養，結果如圖3所示。

圖3 不同碳氮比下的種子培養色價和終產品色價

最終的結果可以清晰的顯示，在碳源固定后，加入硝酸鈉的量對于種子的色素積累同樣有一定的影響。結果表明，如果種子液的色價情況好，最終紅曲米的色價積累情況也好，在本次實驗中，種子液色價和最終紅曲米的色價有一定正相關性，且硝酸鈉的最佳添加范圍在培養基的0.2%～0.4%。

3 結論

紅曲霉（紅曲米）的生產需要從效率以及成本多方面考慮，本文從實際應用角度出發，發現玉米淀粉與硝酸鈉均有較好的紅曲霉色素積累功效，在紅曲霉生長過程中，二者的添加對于紅曲霉的色素積累有一定的疊加作用，另外從另一個角度發現，種子液的色價與最終產品色價有一定的正相關性。結果顯示，當最終種子液采用3%玉米淀粉與0.2 %～0.4 %的硝酸鈉時，種子液的色價積累較好，且在最終紅曲米的接種和最終生產結果上，可以達到產品質量要求。

中國是世界上紅曲霉相關產品最大的生產國和消費國，而紅曲米的生產目前整體條件參差不齊[11]，與現有工業微生物生產模式相比，紅曲米的生產還存在單批產量小、微生物控制難度大、產品質量波動大的問題，在現有條件下，進一步提升紅曲霉類產品的生產工藝及其配套條件是行業需要共同關注的問題。除了基礎食品工業外，紅曲霉的功能特性已經成為近些年的研究熱點，為紅曲霉工業的進一步提升創造了很好的條件。