豬源乳酸菌的分離鑒定及安全性測定

袁翠平，馬宇毅，張 碧，何競銘，李 軍

（廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001）

自20世紀以來，人們在動物的飼料中添加抗生素，來預防機體感染疾病，促進動物機體的快速生長，提高飼料的利用率[1]。由于過度使用抗生素從而導致耐藥菌的產生，致使動物機體免疫力水平下降，造成畜產品藥物殘留，危害人類健康，污染生態環境[2]。人們開始對綠色安全、無殘留，可以有效替代抗生素使用的新型飼料添加劑重視[3]。隨著抗生素替代品的不斷開發和益生菌制劑的深入研究，獲得性能優良的菌株十分重要。

乳酸菌是動物腸道中的正常微生物，在微生態制品當中的地位舉足輕重，具有調節腸道環境，維持腸道內菌群平衡，為機體提供營養物質，促進生長發育，抑制腐敗菌的繁殖，清楚腐敗菌產生的垃圾，促進蛋白質等營養物質的吸收，提高免疫能力，保護動物機體健康的作用[4]，因此，乳酸菌制劑相關的研究具有十分重要意義。菌種的安全是乳酸菌制劑作為后續開發的前提。本研究從豬糞便內分離出一株乳酸菌，并對乳酸菌耐受性、耐藥性、安全性等方面進行檢測，為研制豬用益生菌制劑提供良好的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品

選用購自廣西醫科大學實驗動物中心的昆明小鼠，體重約20g。

試驗樣品來自廣西某養殖場健康豬群的新鮮糞便。

1.2 主要試劑及儀器

LB瓊脂培養基、MRS培養基購自北京陸橋生物技術有限責任公司，革蘭氏染色液、藥敏紙片、生化鑒定試劑購自杭州濱河微生物制劑品有限公司，生理鹽水本實驗室自制，注射器購自北京康為世紀生物科技有限公司，電子天平購自于satorius公司。

2 方法

2.1 樣品采集

取新鮮糞便約10g，置于無菌的三角燒瓶中，加入20 mL無菌MRS液體培養基均勻混和，1000 r/min離心10 min后，取上清液進行細菌分離。

2.2 細菌的分離鑒定

將上清液在超凈工作臺內按照10倍連續稀釋，取各稀釋度分別劃線接種MRS培養皿上，37℃恒溫培養48 h。挑取單個菌落，分別接種LB及MRS培養皿進行純化培養，24 h后觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色鏡檢。

2.3 生理生化鑒定

將純化好的菌種參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常用細菌系統鑒定手冊》進行生理生化鑒定。

2.4 乳酸菌的生物學研究

2.4.1 耐酸性試驗

將分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL）分別接種于pH值為2～8的MRS肉湯培養基中，37℃恒溫培養24h后，測定其OD600nm值。

2.4.2 耐膽鹽性試驗

將分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL）分別接種于含牛膽鹽0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS肉湯培養基中，37℃恒溫培養24h后，測定其OD600nm值。

2.4.3 耐熱性能試驗

將分離菌接種于MRS液體培養基活化（活化后分離菌濃度約為2×108CFU/mL）后，分別置于37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃共計6個溫度梯度，在水中放置1h后，按照1∶200的比例分別接種于MRS肉湯培養基中，37℃恒溫培養24h后，測定其OD600nm值。

2.5 16S rDNA測序鑒定

將純化的菌株經PCR擴增后送蘇州金唯智生物有限公司進行16S rDNA測序。

2.6 耐藥性試驗

采用NCCLS推薦的K-B紙片法，將純化的菌株進行磷霉素、阿米卡星、大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素等24種藥物做敏感性試驗。

2.7 小鼠致病性試驗

選用健康昆明小鼠30只，隨機分為兩組，分別為實驗組和對照組，每組10只。實驗組分為常規劑量組和高劑量組，常規劑量組按106CFU/mL灌胃，高劑量組按108CFU/mL灌胃，對照組灌入等量的生理鹽水。一天一次，連續2周，觀察記錄小鼠的臨床表現情況。

3 結果

3.1 形態特征及染色結果

純化后的菌落為圓形，乳白色，表面光滑濕潤有光澤、邊緣整齊不透明邊、凸起，容易挑起。通過革蘭氏染色鏡檢可見，單個、成對或者成排的革蘭氏陽性桿菌，無芽孢及鞭毛。符合乳酸菌的形態特征。

3.2 生理生化鑒定結果

按照《乳酸細菌的分類鑒定與實驗方法》和《常見細菌系統鑒定手冊》對分離菌株進行生化試驗，初步判斷為乳酸桿菌，命名為G202005。

表1 生理生化試驗結果

3.3 16S rDNA測序

經測序鑒定，與NCBI公布的唾液乳桿菌的同源性為97.6%，進一步證實分離的菌株為乳酸桿菌。

3.4 乳酸菌的生物學研究

菌株G202005在pH值2～8時均能生長，最適宜的pH值為5～7，表明菌株G202005有較強的耐酸能力。隨著膽鹽濃度的增加至0.40%，OD600nm值逐漸降低，但仍有細菌生長，說明菌株G202005有較強的耐膽堿能力。經70℃處理后，仍檢出有細菌生存，說明菌株G202005有較強的耐熱能力。

3.5 乳酸菌的耐藥性測定

藥敏試驗結果顯示，菌株G202005對四環素、多粘菌素甲氧嘧啶、復方新諾明、磺胺異亞唑、羅紅霉素6種藥物產生耐藥性（表2）。

表2 耐藥性試驗結果

3.6 小鼠致病性試驗

兩組小鼠連續口服2周，健康狀況良好，行為、生長、采食量和病理組織剖檢均無明顯異常，說明這株分離菌株對小鼠無毒害作用，安全的。

4 討論

近年來，為了改善腸道內環境，豐富豬群胃腸道的菌群種類，提高豬群的生產性能，大力開發優質益生菌制劑。理想的益生菌菌株應該來自同源動物胃腸道中，從動物糞便中分離的菌株經過胃腸道的篩選，具有較強的耐受能力[5]。乳酸菌通常為分解植物和奶制品中發現的細菌，是國際公認的食品級安全微生物（GRAS），對人類、以及動植物的健康都有益[6]。可以調節畜禽腸道菌群結構，維持腸道菌群平衡。乳酸菌進入動物胃腸道后可以分泌產生多種酶和微量元素，促進畜禽對飼料的消化吸收，促進機體的生長發育[7]。乳酸菌也是免疫激活劑，可以刺激動物機體產生細胞免疫，使體液免疫和細胞免疫同時發揮作用，并且也可以提高免疫球蛋白在腸壁免疫細胞分泌的水平，從而提高動物機體的免疫力，保護機體健康[8]。乳酸菌產生的抑菌物質通常包括細菌素、有機酸、蛋白多肽類等，這些物質可以致使有害菌病菌裂解死亡，也可協同其他抑菌物質將病原菌殺滅，或者降低環境的pH從而抑制腸道有害菌的生長[9]。

本試驗對健康豬群糞便中分離菌株形態學特性、生理生化、16S rDNA測序鑒定，通過藥敏試驗、小鼠致病性試驗以及安全性評價，篩選出一株具有優良特性的乳酸菌，該菌具有耐熱、耐酸、耐膽堿、安全無毒的特點，在豬飼料益生菌添加劑方面有潛在的應用前景。