東亞飛蝗pSMC重組抗原表達及多克隆抗體制備

王麒霖，邱 佳，余 瑛，夏玉先

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶大學 生命科學學院，重慶 400030)

染色體結構維持蛋白(structural maintenance of chromosome，SMC)廣泛存在于從細菌到人類的生物中，是一類結構高度保守的ATP酶家族成員蛋白。SMC蛋白呈V形結構，有2條長臂，每一長臂末端都有一個ATP結合的頭部結構域，其分子結構中包括5種可識別的結構域：NH2-末端核苷三磷酸(NTP)結合結構域、鉸鏈區、2個由鉸鏈分隔的螺旋線圈和一個COOH-末端結構域[1]。

在真核細胞中，目前發現的SMC蛋白有6個(SMC1-6)[2]，這些蛋白質以SMC1與SMC3、SMC2與SMC4、SMC5與SMC6的異二聚體形式與非SMC成員(Kleisin和HEAT亞基)結合行使功能[3]。 SMC與非SMC形成了3種復合物：黏著素(SMC1/3)，對染色單體的黏著起關鍵作用；凝聚素(SMC2/4)，促進姐妹染色單體的壓縮和后期分離；SMC5/6復合物，促進DNA修復并影響未受損細胞的染色體穩定性[4-5]。

SMC的功能絕不僅僅是維持染色體結構的完整性，它很可能還參與了多種基因的表達調控及免疫調節。Smc家族成員(包括Smc2/3/4/5)可促進LPS誘導的IL-6生成，提示Smc家族成員在促進先天免疫中的作用。其中，Smc4是炎癥固有反應的積極調節因子。Smc4通過向nemo啟動子招募H4K5ac促進NF-κB和IRF3的固有激活，通過表觀遺傳方式增強nemo的轉錄，隨后誘導促炎性細胞因子和IL的激活[6]。Smc5/6是抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)轉錄的限制因子，當定位于核結構域10(ND10)時抑制HBV轉錄。HBV通過表達HBV X蛋白(HBx)來對抗這種限制，Smc5/6被降解時，HBV和HBx陰性病毒在PHH細胞中建立高水平感染，而不誘導干擾素或其他細胞因子的產生[7]。

Smc與腫瘤的發生有關。臨床病理研究表明：SMC在乳腺癌、結腸癌、肝癌等多種腫瘤組織表達[8-10]，參與了癌細胞增殖、遷移、侵襲過程[11]，但詳細的機制仍不清楚。與正常組織相比，肝癌組織中Smc4 mRNA和蛋白高表達。SMC4表達下調則能降低肝癌細胞的增殖[12]。與此類似，在異種移植裸鼠中，SMC2缺失抑制膀胱癌細胞增殖，促進凋亡，減少集落形成，減少腫瘤生長。SMC2的過度表達則恢復TUG1缺失細胞的生長，提示：SMC2是膀胱癌的原癌基因。因此，SMC的抑制或缺失可能對癌癥治療有潛在的意義[13]。此外，染色體結構畸變的誘發也可能與Smc直接相關。SMC蛋白在細胞周期中的重要性可以通過Smc基因在人類癌細胞系中經常發生突變這一事實進一步證實[14]。

近期的文獻報道提示：SMC也在一些炎癥性疾病中高表達，在T細胞中SMC可能參與了激活TLR和病毒引發的先天性免疫反應[6]。但人們對于SMC在免疫調節中的作用機制仍然知之甚少。本團隊最近研究發現了一種SMC在東亞飛蝗血淋巴吞噬細胞中高表達(命名為pSMC)，該SMC在吞噬細胞中的功能和天然免疫中的作用有待研究。

本研究以東亞飛蝗為材料，從其血細胞中克隆了含有SMC保守結構域的pSMC249-383抗原片段，經重組表達、純化獲得了重組抗原，以該重組抗原免疫小鼠獲得了多克隆抗體，為下一步進行pSMC相關功能研究奠定了工作基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、EcoR Ⅰ、Hind III、DNA連接酶均購自TaKaRa公司，Ultrapure RNA Kit(DNase I)、HiFiScript cDNA Synthesis Kit購自康為世紀公司，質粒提取試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒購自OMEGA試劑公司，熒光磁珠購自德國Chemicell公司，其他試劑均為國產分析純。

蛋白質純化試劑及配方：細胞裂解液：25 mmol/L NaH2PO4(pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，0.1%tween20，0.1 mmol/L PMSF。 平衡溶液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。100 mmol/L咪唑洗脫液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，100 mmol/L咪唑。400 mmol/L咪唑洗脫液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，400 mmol/L咪唑。

1.1.2動物、質粒及菌株

東亞飛蝗由重慶大學基因中心提供。BALB/c小鼠購自重慶醫科大學動物中心。質粒pET30a(+)、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)細胞為本實驗室保存。

1.1.3pSMC序列

該序列數據來源于東亞飛蝗血淋巴轉錄組測序結果，具體的氨基酸序列如下：

DGRRPSAPAAASLPRYNSFSSDDEGQREERKT

LPEENGFLTGENSQRQRDKKKPLLEENGFTPADTS

YRQRDNKKPVIEENGFTPADTSYTSGSGSVMGRDV

GPPPPPPPRAASAMSLHLQPPPDKPDRHASTTAPE

EAGLHVSAGELLGRTHEELVLLLIQLRRQSAAVCK

AMETCHMEIEAQARFVELETPKRLEHLKKLEDLK

RHLLDLEKQYEKGKPLVNLVDNMVKLGSLYRGPS

ARERLEFNQKVQEKRLLAEERRDWDRLSPDRTQL

QAKVQQLYRLDRLLQEESSTLQSLQQDKELLERAL

AGLRHKLQNNSHFSPLEVEHFRKQQRALERELSRV

RLLLAHNSKKLEETVAENARLEQELVILRQKLQQPI

TEPGGGTAALEAELRRVQRLVGDLTRQRKQLSLQV

QQLTQQRPGAAGVSSSRGSSSMPSRKRHHSTWLVT

DLDTLETQDLGVETAVSPASSQATTATSPASTLRSP

MYTSREAGGGMEMESEVPPPLPAPPEIPPEYPPPPP

PPPPPSEEALLGPGEQYCPHVDINEADDRMKRFYG

IIPKEKQQEIKTVRIVKRESERRQRDRDRSGNIGIPL

TNGGVSTGKRPSAADESEIANSTSEVQGFQKQQLG

PVEEEVSESSRPFSETLLSASVDDDEEDDDPAIDLQ

FQRSLSLPRGFGKRERLSGAPPPPPIRSASPRGEGM

GTGTNSRQQRVRFKDGDYTSVSSSPSPSPSPSQLSP

VFKSQAARAIVQEVSQSPRKRAVPKEKRRHHTVSS

SKPLLDMESSASRMGSARSRDDLDMERALRPRRIN

APDVVRSTMSHKDFKYNENTIDSILGTPSKIIIPERYI

PEQAPELSAEEQLHRLKKAEAIRKMLSETSAISASE

GIEEEHQTATLKKKVAAEKRQREHLLQLNQLLAR

QQVMEKSKVVAGSTCAPTME

1.2 pSMC基因的生信分析

采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLASTp進行pSMC序列結構分析，亞細胞定位采用Euk-mPLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#)分析，抗原表位采用(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)網站工具進行分析。

1.3 pSMC抗原擴增引物設計

采用Primer Premier5設計引物，序列分別為，F引物：5′-GCAGAATTCCAGAAGGTCCAGGAGAAACG-3′；R引物：5′-CTCAAGCTTTCATGGCTCTGTTATTGGCTGT-3′。

1.4 蝗蟲血淋巴總RNA的提取與pSMC基因的擴增

用RNA試劑盒提取東亞飛蝗成蟲血淋巴總RNA，按試劑盒說明進行反轉錄獲得cDNA。

pSMC249-383PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 7 min。擴增結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.5 pET30a(+)-pSMC249-383原核表達載體的構建

將得到的PCR產物回收純化，純化的PCR產物和pET30a(+)質粒分別用EcoR Ⅰ、Hind III進行雙酶切處理。酶切后的PCR產物和pET30a(+)質粒用T4DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞。用含卡拉霉素的LB轉化平板篩選轉化子。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定、質粒酶切鑒定、DNA測序分析，篩選鑒定pET30a(+)-pSMC249-383重組質粒。

1.6 重組pSMC249-383的原核表達及純化

將鑒定序列正確的重組質粒，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，在37℃下誘導培養，待OD600至0.6～0.8時，加入IPTG(1 mmol/L)誘導表達5 h，SDS-PAGE確定重組蛋白的表達形式，超聲破碎法破胞。從1L發酵液中收獲菌體，用PBS(含1mmol/L PMSF)10 mL制備菌懸液，超聲條件為80 Hz，超聲5 s，間隔5 s，總時間30 min。超聲至溶液透明，高速離心收集上清液，用Ni-NTA柱對上清液中的目的蛋白進行純化，SDS-PAGE檢測目的蛋白純度，BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.7 Anti-SMC抗體制備及pSMC的細胞定位

對純化后的重組pSMC249-383蛋白進行SDS-PAGE電泳，用1 mol/L氯化鉀染色，切下含有目的蛋白的膠條，然后用超純水洗滌脫色，在膠條透明無色后，加入液氮研磨，用PBS重懸，注射BALB/C小鼠腹腔進行免疫，免疫劑量為每只小鼠每次100 ug pSMC249-383蛋白，免疫周期為2周1次，3次免疫后對小鼠進行尾部采血測定血清效價，當效價大于5 000時，收獲血清。

pSMC的細胞定位采用免疫熒光法檢測。向東亞飛蝗體內注射紅色熒光標記的納米磁珠，3 h后采血，制作血涂片。血涂片于37 ℃干燥1 h，PBS洗5 min，重復3次；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；0.3% Triton X-100處理5 min，PBS洗3次；加封閉液(PBS含3%BSA)， 37 ℃，封閉1 h，PBS洗3次；加PBS稀釋的血清(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次；加FITC標記的兔抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次；加入10倍稀釋后的DAPI處理2 min，PBS洗3次。熒光顯微鏡觀察并拍照，采集圖像軟件為OLYMPUS CellSens Standard 1.14。

2 結果與分析

2.1 pSMC基因的生物信息學分析

2.1.1結構域分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中對SMC蛋白質結構進行分析。結果(圖1)顯示：pSMC蛋白由933個氨基酸殘基組成，SMC保守結構域主要分布在第200-422區段。

圖1 pSMC結構域分析示意圖

2.1.2蛋白質的亞細胞定位

對pSMC氨基酸序列進行在線分析(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#)，結果顯示pSMC蛋白定位于細胞質和細胞核。

2.1.3抗原表位分析

在線分析(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl) pSMC蛋白的抗原表位。

結果(圖2)顯示：pSMC蛋白在N端50-450肽段的抗原表位最為豐富。本研究選擇pSMC的249-383肽段作為pSMC抗原區段進行克隆，將該片段命名為pSMC249-383。

圖2 pSMC蛋白抗原表位分析曲線

2.2 蝗蟲血淋巴總RNA的提取和pSMC249-383片段的擴增

用RNA提取試劑盒提取蝗蟲血淋巴總RNA，瓊脂糖凝膠電泳(圖3(a))顯示RNA條帶完整，無降解，且RNA的OD260/OD230值和OD260/OD280值均大于1.8，表明提取的RNA純度較高，適合作為擴增模板。

將提取的總RNA用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以此為模板對pSMC249-383片段進行擴增，電泳檢測結果表明擴增產物大小約為405bp(圖3(b))，與預期的片段長度符合。

a.蝗蟲血淋巴總RNA提取.M:DL2000 DNA marker；1-2:蝗蟲血淋巴總RNA;b.pSMC249-383的PCR.M:DL2000 DNA marker；1:pSMC249-383的PCR產物圖3 pSMC249-383片段擴增圖

2.3 pET30a(+)-pSMC249-383原核表達質粒的構建

擴增的pSMC249-383和pET30a(+)質粒分別用EcoRI和HindIII進行雙酶切，然后回收純化、連接。將連接產物轉化DH5α感受態細胞，對轉化子進行菌落PCR鑒定，得到陽性菌落的電泳條帶大小約405bp(圖4(a))。

對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行過夜培養，提取其質粒，用EcoR I和 Hind III酶切處理。結果顯示該質粒含有目的條帶(圖4(b))，為重組質粒。對此重組質粒的DNA測序結果顯示：插入片段為pSMC249-383，表明pET30a(+)-pSMC249-383重組表達載體構建成功。

a.轉化子的菌落PCR鑒定.M:DL2000 DNA marker；1-2:轉化子PCR產物; b.重組質粒pET30a(+)-pSMC249-383的酶切鑒定.M:DL2000 DNA marker；1:EcoR I 和 Hind III 酶切重組pET30a(+)-pSMC249-383；N:DL10000 DNA marker圖4 pET30a(+)-pSMC249-383重組質粒鑒定圖

2.4 pSMC249-383重組蛋白表達形式分析

將構建成功的pET30a(+)-pSMC249-383重組質粒轉化BL21(DE3)，在LB培養基中進行發酵培養，經IPTG誘導后分離發酵液中的菌體。菌體經超聲破碎后，分離上清與沉淀，進行SDS-PAGE電泳。電泳結果(圖5)顯示：pSMC249-383重組蛋白大量存在于裂解上清中，在沉淀中較少。說明pSMC249-383重組蛋白在BL21(DE3)中主要為可溶性表達。用電泳法測定的pSMC249-383重組蛋白分子量大小為21.8KD，與預期一致。

2.5 pSMC249-383重組蛋白的純化

培養1L pET30a(+)-pSMC249-383/BL21(DE3)發酵液，取誘導培養后菌體的裂解上清，用Ni親和層析技術[11-12]純化pSMC249-383重組蛋白，對純化過程中的洗脫樣品用SDS-PAGE電泳進行檢測(圖6)。

M：蛋白質分子量marker；1：pET30a(+)-pSMC249-383/BL21裂解上清；2：穿柱液；3-4：20mM/L咪唑洗脫液；5-7：100mM/L咪唑洗脫液；8：400mM/L咪唑洗脫液圖6 SDS-PAGE檢測pSMC249-383蛋白純化圖

結果顯示pSMC249-383重組蛋白能較好地被Ni柱吸附，用100 mmol/L咪唑溶液洗去非特異性結合蛋白，再用400 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白，可獲得純度較高的重組pSMC249-383蛋白。image J軟件分析顯示pSMC249-383重組蛋白純度為80%，濃度為1.98 μg/μL，1 L發酵液可獲得純化后pSMC249-383重組蛋白約20 mg。

2.6 pSMC的抗血清制備與pSMC249-383的亞細胞定位

用SDS-PAGE分離純化后的pSMC249-383蛋白，切取含有pSMC249-383蛋白條帶的膠條，粉碎膠條制成懸液免疫小鼠，ELISA法檢測顯示獲得的pSMC249-383抗血清效價大于1∶64 000。

采用免疫熒光技術檢測pSMC在東亞飛蝗血淋巴細胞中的定位。結果(圖7)顯示：pSMC主要分布于細胞核，且吞噬了紅色熒光磁珠的吞噬細胞細胞核中pSMC信號較其他細胞更強，表明pSMC定位于細胞核，在吞噬細胞中高表達。

FITC：FITC標記的羊抗鼠二抗；Magnetic beads：紅色熒光標記的納米磁珠；Merge：紅綠通道疊加圖7 pSMC在蝗蟲血淋巴細胞中的定位分析圖

3 多克隆抗體制備

本研究采用原核pET系統成功克隆并表達了pSMC249-383抗原，用該重組表達的抗原免疫小鼠獲得了高效價的抗血清。一般來說，制備多克隆抗體比單克隆抗體過程簡單，周期更短，多克隆抗體靈敏度更高，但特異性通常不如單克隆抗體好[15]。本研究通過對pSMC的核酸、蛋白序列進行生物信息學分析，選取其抗原表位豐富且特異性較好的區段進行克隆，獲得了免疫原性及特異性均較好的重組抗原pSMC249-383。該重組抗原在大腸桿菌中以包含體形式表達，不僅表達量高，且因帶有6×His標簽純化方便[16]。為了獲得高純度抗原，本研究對Ni親和層析純化的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，從凝膠中切取含目的蛋白條帶的凝膠膠條，用于免疫小鼠。該方法不僅簡化了獲得高純度目的蛋白的純化步驟，而且凝膠在免疫過程中充當了佐劑的作用[17-18]，能有效增強小鼠的免疫應答。本實驗使用該方法在3次免疫后SMC多克隆抗體血清效價達1∶64 000，表明該方法便捷且省時高效。

4 結論

對pSMC的序列分析顯示，pSMC中含有核定位信號序列；免疫熒光檢測結果顯示，pSMC在東亞飛蝗血淋巴吞噬細胞高表達，且定位于細胞核。由于吞噬細胞為天然免疫細胞，SMC在DNA復制、基因表達調控中至關重要，pSMC在吞噬細胞中如何維持DNA穩態，影響或調控天然免疫相關過程值得關注。