甲胎蛋白AFP的原核表達、純化及鑒定

王桂玲，冉 皚，吳勝昔，谷志鵬，黃 蕾，龔呂鴻

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)又稱“癌中之王”，是一種常見且致死率極高的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤死亡率中高居第三，嚴重威脅人類的健康和生命[1]。我國每年約39萬人罹患肝癌死亡，數量超過全球肝癌死亡人數的一半。肝癌侵襲力強，經手術切除、肝移植后，患者5年的生存率僅為70%，加上肝癌的預后較差，復發風險較高，因此HCC的早期診斷意義重大[2]。

人甲胎蛋白(alpha-Fetoprotein，AFP)是1個分子量約為70 kDa的糖蛋白，含有591個氨基酸，屬白蛋白家族，源于胚胎內胚層組織細胞，主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成[3]。當胎兒發育至12～16周時，可在胎兒的血液循環中檢測到高達3 g/L的AFP，妊娠30周達到最高峰，之后逐漸下降。胎兒出生2～3月后，隨著干細胞表達下降，體內的AFP轉變為白蛋白且在血清中只能檢測到微量的AFP蛋白，出生后的第二年接近成人水平，正常人血清中AFP的含量會維持在1個較低水平(<20 μg/L)[4-6]。1964年，前蘇聯專家Wong等[7]在肝癌患者血清中首次發現AFP，截至目前，AFP被認為是肝癌診斷的最佳生物標志物。肝癌患者表現出臨床癥狀的前8個月時，血清中AFP的含量已經顯著升高，因此AFP在臨床上廣泛用于原發性肝癌的診斷及療效監測。AFP具有很多重要的生理功能，如運輸功能、免疫抑制、T淋巴細胞誘導凋亡、作為生長調節因子的雙向調節功能等[8]。血清中AFP濃度的異常增高與多種惡性疾病的發展有密切關系，血清中AFP>400 μg/L并持續一個月以上則提示肝癌高風險。AFP可用于評估肝癌的預后性，濃度升高則提示預后不良。此外，AFP還可用于肝癌高危人群的篩查[9]，乙型肝炎性或丙型肝炎性、肝硬化患者每6個月進行一次血清AFP的跟蹤隨訪和腹部超聲。目前，肝癌血清標志物AFP的檢測方法主要以抗原抗體發生免疫結合反應為基礎，然而國內生產的AFP檢測試劑的質量不一，國外進口價格昂貴。因此，制備純度高、特異性強、成本較低的AFP蛋白可為肝癌的早期快速檢測提供有效試劑。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

BL21(DE3)感受態細胞購于上海唯地生物科技有限公司；pET28a(+)質粒載體由重慶理工大學基因工程實驗室贈予；pET28a(+)-AFP質粒、pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌是由蘇州金唯智生物科技有限公司構建。

1.2 主要試劑及儀器

DNA Marker、QuickCut NdeI、QuickCut XholI限制性內切酶購自TaKaRa；小型質粒提取試劑盒購自北京博邁德基因技術有限公司；6×Loading Buffer購自北京金克隆生物技術有限公司；蛋白質分子質量標準購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；卡那霉素和IPTG分別購自賽國生物科技有限責任公司和美國Genview公司；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自biosharp公司；HRP-羊抗小鼠IgG購自美國Proteintech公司；BCA蛋白定量測定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；NGC蛋白純化系統購自美國伯樂生命醫學(上海)分公司；Nano-300微量核酸蛋白檢測儀購自上海嘉鵬科技有限公司；Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購自美國GE公司。

1.3 序列分析與合成

根據GenBank上發布的AFP全基因序列(GenBank登錄號：NM_001134.2)，對AFP基因序列分析及大腸桿菌密碼子偏好性優化，在AFP全長基因序列的C-端及N-端各加一組6×His-Tag，以pET28a(+)作為原核表達載體。交由蘇州金唯智公司進行基因構建與合成。

1.4 pET28a(+)-AFP重組質粒的酶切與鑒定

用接種環蘸取少量pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌，劃線接種于LB固體培養基(含有50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃培養30 min后倒置培養過夜。次日，挑取單菌落并接種于5 mL的LB液體培養基試管(含50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃，180 rpm，振蕩培養12 h，測量菌液的OD600值達0.6～0.8時，利用質粒小量提取試劑盒進行重組質粒的提取。測定pET28a(+)-AFP重組質粒的濃度，確保在下述酶切反應體系中質粒數量可達500～1 000 ng。利用快切酶NdeI、XholI進行雙酶切鑒定，反應體系如表1所示，37 ℃酶切反應30 min。對雙酶切產物進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，100 V，80 mA，電泳30 min。

表1 pET28a(+)-AFP的雙酶切體系

1.5 重組質粒的轉化及重組菌的保存

將重組質粒以熱激法轉入大腸桿菌感受態細胞，具體操作參照文獻[10-11]。將轉化成功后的pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)進行菌種保存，具體操作步驟如下：挑取平板上大而飽滿的單菌落，接種到5 mL的LB液體培養基，37 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養過夜，次日，將試管中的菌液同30%甘油溶液(經高壓滅菌)按1∶1的比例混勻，長期保存于-80 ℃。

1.6 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組蛋白的表達與鑒定

按上述步驟對pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌進行單菌落培養并接種至5 mL LB液體培養基，待菌液培養至指數生長期，加入適量濃度的IPTG，150 r/min，誘導擴增8 h。對誘導表達的菌液進行超聲破碎，10 000 r/min離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用適量的滅菌水重懸，取20 μL沉淀懸液與5 μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸變性10 min，進行SDS-PAGE電泳鑒定。空載體按照相同條件處理。

1.7 pET28a(+)-AFP重組蛋白誘導表達條件篩選

pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌劃線接種并培養至5 mL試管，37 ℃振蕩培養至菌液的OD600值達0.6～0.8時，將各試管按誘導溫度梯度(16、25、30、37 ℃)、IPTG濃度梯度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)及時間梯度(2、4、6、8、10、12 h)進行誘導條件篩選。利用SDS-PAGE電泳對樣品進行鑒定，從而得到AFP重組蛋白大量表達的最佳誘導表條件。

1.8 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌的擴大培養

按照上述步驟擴大培養AFP重組基因工程菌后，根據篩得的最佳誘導條件使菌液大量表達AFP重組蛋白。

1.9 重組蛋白pET28a(+)-AFP包涵體的處理及純化AFP重組蛋白

1.9.1包涵體處理

按上述步驟對pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)工程菌進行二次活化，以最佳誘導條件大量表達AFP重組蛋白，10 000 rpm，4 ℃離心10 min后棄上清，向沉淀中加入PBS(1∶30)。10 000 rpm，4 ℃離心10 min后棄上清，向沉淀中加入裂解液(1∶20)和PMSF(1∶100)，超聲破菌，14 000 rpm，4 ℃低溫離心15 min后棄上清并收集包涵體沉淀。向沉淀中加入裂解液(1∶30)，渦旋至沉淀溶解。14 000 rpm，4 ℃離心15 min后棄上清。向沉淀中加入8M尿素(1∶30)，4 ℃低速攪拌15 h。將溶解的產物離心(14 000 rpm，4 ℃離心10 min)并收集上清(包涵體粗提液)。

1.9.2親和層析鎳柱純化AFP重組蛋白

利用NGCTMChromatography System對pET28a(+)-AFP重組蛋白包涵體進行親和層析純化，具體操作步驟見文獻[12]。

1.10 AFP重組蛋白的Western blot鑒定

取20 μL純化后的蛋白樣品與5 μL 5×SDS上樣緩沖液，渦旋儀混勻后置沸水中變性10 min，然后進行SDS-PAGR電泳鑒定。按照Western blot步驟[13]對純化后的蛋白樣品進行特異性鑒定。

1.11 AFP重組蛋白樣品的濃度測定

按照北京鼎國昌盛BCA蛋白濃度測定試劑盒的步驟測定AFP重組蛋白樣品的濃度，具體操作如下：

1) 配制BSA蛋白標準品溶液：用滅菌的雙蒸水稀釋蛋白標準品至0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL；

2)稀釋后的蛋白標準品按照10 μL/孔逐次加到96孔板中，加入10 μL待測蛋白樣品，每個樣品做3個平行組；

3) 將試劑盒中A液和B液按照50∶1的比例配制工作液，200 μL/孔，將96孔板置37 ℃恒溫培養箱中孵育30 min；

4) 提前預熱MULTISKAN GO分光光度儀，在562 nm下測得該樣品的OD562值，繪制標準曲線以測定AFP重組蛋白的濃度。

2 實驗結果

2.1 酶切鑒定結果

用限制性核酸內切酶Nde I和Xhol I對重組質粒pET28a(+)-AFP進行雙酶切鑒定，結果如圖1所示，在1 875 bp(目的基因)及5 369 bp(空載體pET28a(+))處均出現了核酸電泳條帶，此結果與預期相符合，證明pET28a(+)-AFP重組質粒構建成功。測序結果表明該克隆序列各連接位點及閱讀框架正確，與預期相符合。

M：DNA分子質量標準；1-2：未酶切質粒；3-4：重組質粒經Nde I、Xhol I雙酶切圖1 重組質粒pET28a(+)-AFP的酶切鑒定

2.2 重組蛋白pET28a(+)-AFP的誘導表達鑒定

挑取5個pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)單菌落，以pET28a(+)/BL21(DE3)菌株作對照，在相同條件下(37 ℃，IPTG濃度為1 mmol/L，150 rpm誘導8 h)誘導表達，誘導后的菌液經超聲破碎和離心，用適量的滅菌水對菌體沉淀重懸，SDS-PAGE電泳鑒定結果如圖2所示，5個AFP重組單菌落在經過相同條件誘導后，在75 kDa處均出現誘導表達的蛋白條帶，pET-28a(+)/BL21(DE3)菌株在此處沒有出現相應的蛋白條帶，未誘導對照組只是少量表達，此結果與預期計算的分子量大小一致，說明該重組菌可成功表達AFP重組蛋白。

M: 蛋白質分子質量標準；1：pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組；2：1號菌誘導前；3：1號菌誘導后4: 2號菌誘導前；5：2號菌誘導后；6：3號菌誘導前；7：3號菌誘導后；8：4號菌誘導前；9：4號菌誘導后；10: 5號菌誘導前；11：5號菌誘導后圖2 AFP重組蛋白的鑒定

2.3 pET28a(+)-AFP重組蛋白的最佳誘導條件的篩選

通過對誘導溫度，誘導劑IPTG濃度，誘導時間的篩選，獲得AFP重組蛋白大量表達的最佳誘導條件：30 ℃，0.1 mM IPTG，誘導8 h。

1) 設定IPTG濃度為1 mmol/L，在4個溫度條件(16、25、30、37 ℃)中，150 r/min振蕩誘導6 h。結果如圖3所示，當誘導溫度為30 ℃，AFP重組蛋白的表達量更高，故選擇30 ℃為AFP重組蛋白的最佳誘導溫度。

M: 蛋白質分子質量標準；1: pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組；2: 未誘導對照；3:16 ℃誘導上清；4: 16 ℃誘導沉淀；5: 25 ℃誘導上清；6: 25 ℃誘導沉淀；7: 30 ℃誘導上清；8: 30 ℃誘導沉淀；9: 37 ℃誘導上清；10: 37 ℃誘導沉淀圖3 重組蛋白AFP的最佳誘導溫度篩選結果

2) 當誘導溫度為30℃，設定5個IPTG濃度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)，150 r/min振蕩誘導6 h。結果如圖4所示，當IPTG濃度為0.1 mmol/L，AFP重組蛋白的表達量更高，故選擇0.1 mmol/L的IPTG為最佳誘導劑濃度。

M:蛋白質分子質量標準；1：未誘導對照；2：0.1 mmoL/L誘導上清；3：0.1 mmoL/L誘導沉淀；4：0.3 mmoL/L誘導上清；5： 0.3 mmoL/L誘導沉淀；6：0.5 mmoL/L誘導上清；7：0.5 mmoL/L誘導沉淀；8：0.75 mmoL/L誘導沉淀.9：0.75 mmoL/L誘導沉淀；10：1 mmoL/L誘導上清;11：1 mmoL/L誘導沉淀圖4 重組蛋白AFP最佳誘導劑濃度篩選結果

3) 當誘導溫度為30 ℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，150 r/min振蕩誘導2、4、6、8、10、12 h。結果如圖5所示，當誘導時間為8 h或10 h時，AFP重組蛋白的表達量較高，綜合確定最佳誘導時間為8 h。

M:蛋白質分子質量標準；1：2h誘導上清；2：2 h誘導沉淀；3：4 h誘導上清；4：4h誘導沉淀；5：6 h誘導上清；6：6 h誘導沉淀；7：8 h誘導上清；8：8 h誘導沉淀9：10 h誘導上清；10：10 h誘導沉淀；11：12 h誘導上清12：12 h誘導沉淀圖5 重組蛋白AFP最佳誘導時間篩選結果

2.4 AFP重組蛋白的純化

按照最佳誘導條件獲得大量表達的AFP重組蛋白后，通過洗滌包涵體、溶解變性、純化及蛋白復性，獲得AFP重組蛋白。如圖6所示，300 mM的咪唑可將AFP目的蛋白完全洗脫。收集280 nm紫外吸收峰下的AFP重組蛋白樣品并進行SDS-PAGE電泳純度鑒定，結果如圖7所示，純化后的AFP重組蛋白分子量與預期相符且純度較高。

圖6 NGCTM親和層析系統純化AFP重組蛋白圖譜

M：蛋白質分子質量標準；1-12：純化后的重組蛋白AFP；13：純化前的樣品圖7 pET28a(+)-AFP重組蛋白純化鑒定

2.5 重組蛋白pET28a(+)-AFP的Western blot鑒定

Western blot結果顯示:實驗組(1-2)在75KD處有明顯的蛋白印跡出現(見圖8)，pET28a(+)/BL21(DE3)對照組(3-4)無條帶，表明經Ni柱純化后制得的AFP重組蛋白特異性良好。

1-2：重組蛋白AFP；3-4：pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組圖8 重組蛋白AFP Western blot 鑒定

2.6 重組蛋白AFP的濃度測定

用BCA法測定AFP重組蛋白的濃度，結果如表2所示。標準曲線如圖9所示，其中，回歸方程式：y=1.852 6x-0.238 7,R2=0.999 1，線性關系良好。

表2 pET28a(+)-AFP濃度測定

圖9 重組蛋白AFP濃度測定標準曲線

3 結論

1) 大腸桿菌表達系統分子遺傳結構清楚、操作簡單，生長迅速、適于大規模發酵經濟，利用該系統制備AFP重組蛋白具有操作簡單、經濟實用的優勢。

2) 本研究選擇pET28a(+)作為原核表達載體，可使AFP目的基因高效表達。AFP全長基因序列兩端各加的一組6×His-Tag有助于AFP重組蛋白與Ni柱上的金屬離子螯合，從而實現雜蛋白的有效分離。

3) 通過優化AFP重組蛋白的誘導溫度、誘導時間以及誘導劑IPTG濃度，最終確定在30 ℃，0.1 mM的IPTG，誘導8 h的條件下，AFP重組蛋白可大量表達。

4) Ni柱純化的實驗結果證明：目的基因兩端的2組6×His-Tag不僅提高了Ni柱純化的效率，且不會影響AFP蛋白的免疫原性。

5) AFP重組蛋白的Western blot鑒定結果表明：原核表達的AFP重組蛋白與市售AFP單抗可發生強烈的特異性結合。

6) 本研究制得具有良好生物活性且純度較高、特異性強的AFP重組蛋白，為后續制備AFP單克隆抗體以及AFP抗原檢測方法的研究提供了有效試劑。