前列腺特異性膜抗原靶向近紅外熒光手術導航技術在前列腺癌中的應用進展

馮科森，焦健華,，張景良，秦衛軍

(1.中國人民解放軍61035部隊衛生隊，北京昌平 102205；2.空軍軍醫大學西京醫院泌尿外科，陜西西安 710032)

前列腺癌是男性最常見惡性腫瘤之一，近年來其發病率在全球及國內均迅速上升[1-2]。目前，手術是治療前列腺癌最有效的方法之一，而根治性前列腺癌切除術和盆部淋巴結清掃術是最常用術式[3]。根治性前列腺癌切除術中，術者確定切緣范圍主要依靠術前影像學檢查、術中肉眼所見及探查、術者自身經驗和術中冰凍病理檢查。手術切除范圍過大會損傷正常組織，影響尿控等正常功能；而切除范圍過小會導致陽性切緣，患者容易出現復發。在盆部淋巴結清掃術中，術者也很難在手術中實時分辨淋巴結是否已出現轉移。目前，歐洲泌尿外科學會(European Association of Urology，EAU)和美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南均推薦對高風險患者進行擴大盆部淋巴結清掃術[3]。但淋巴結清掃范圍越大，導致相關并發癥發生的可能性也越高[4]。因此，如何在手術中盡可能保留正常組織和功能，同時對前列腺癌侵犯區域進行徹底切除是臨床醫生經常需要面對和解決的問題。靶向熒光術中導航技術正是解決這一問題的良方，本文就前列腺癌中前列腺特異性膜抗原(prostate membrane specific antigen,PSMA)靶向近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)手術導航技術的研究進展進行綜述。

1 靶向NIRF手術導航技術的基本概念

1.1 光學分子影像學光學分子影像學源自1999年WEISSLEDER教授最早提出的分子影像學(mo-lecular imaging)技術[5]，是利用生物體自發熒光對分子和分子作用途徑檢測的一種無創技術，成像依靠不同波長熒光[6]。該技術常用波長為400～1 000 nm，包括可見光波段(波長：400～650 nm)和NIRF波段(波長>650 nm)[6]。與可見光波段相比，NIRF具有波長較長、組織穿透力較強、散射較小等優點，更適合進行體內成像。

1.2 靶向光學分子影像手術導航靶向光學分子影像手術導航是一種基于光學分子影像學技術，對腫瘤進行細胞及分子層面靶向實時在體成像的技術[7]。在靜脈注射腫瘤靶向NIRF染料后，腫瘤靶向熒光染料通過配體-受體結合作用實現體內自動尋靶。施術者利用高敏感度的熒光采集設備及快速圖像融合計算，實現術中實時熒光成像以精準切除腫瘤組織及淋巴結轉移[7]。

1.3 靶向NIRF染料靶向NIRF染料通過將NIRF染料與靶向惡性腫瘤特異性標志物的配體，如抗體、多肽、小分子化合物相結合從而實現熒光染料在手術中對惡性腫瘤的靶向成像。傳統非靶向NIRF染料如吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)等主要依靠實體惡性腫瘤的高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention,EPR)進行成像，不連接腫瘤靶向特異性配體，不具有針對惡性腫瘤特異靶向性，因而難以在手術中準確分辨前列腺癌和正常組織。與這些傳統NIRF染料相比，靶向NIRF染料可通過配體-受體特異性結合作用，精準識別惡性腫瘤，因此具有靶向性更好、特異性更高、與惡性腫瘤結合時間更長等優點。靶向NIRF染料的使用與否也是靶向NIRF手術導航技術與非靶向NIRF手術導航技術的區別所在。

1.4 PSMAPSMA是一種具有葉酸水解酶和N-乙酰化α-鍵酸性二肽酶(N-acetylated a-linked acidic dipeptidase，NAALADase)活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌細胞中顯著高表達且其表達量為生理表達量的100倍以上[8]。有研究表明，PSMA可在絕大多數原發性前列腺癌和98%前列腺癌淋巴結轉移中高表達[9]，并且其表達量隨Gleason分期升高而增加[10]。因此，PSMA作為一種前列腺癌特異性高表達膜蛋白，便于和靶向染料結合，是靶向NIRF染料的理想靶點。

2 常用設備

靶向NIRF手術導航技術所使用的設備一般是具有近紅外波段熒光成像功能的熒光手術設備。國外研究中常用的設備包括Artemis、FDPM imager、FLARE、Fluobeam、HyperEye、熒光腹腔鏡Karl Strorz/PINPOINT、Kit-FLARE、Mini-FLARE、Photodynamic Eye(PDE)、Munich/SurgOptix原型攝像系統、Goggle系統、加裝NIRF成像模塊的達芬奇手術機器人等設備[11-12]。目前國內報道的臨床研究中所使用的設備有：楊曉峰等[13]在前列腺癌根治性切除術和擴大盆腔淋巴結清掃中使用的熒光腹腔鏡系統。以上具有近紅外波段成像功能的設備均可進行靶向NIRF手術導航，因此靶向NIRF染料的研發也就成為該研究領域的熱點。與傳統的非靶向NIRF成像相比，PSMA靶向NIRF染料是PSMA靶向NIRF手術的關鍵技術，能夠極大提高前列腺癌病灶的信噪比，為減少陽性切緣和精準清除轉移淋巴結提供重要保證。下面我們進一步對PSMA靶向NIRF染料研究進展進行綜述。

3 靶向熒光染料

根據靶向PSMA的配體種類不同，可以將PSMA靶向NIRF染料分為抗體靶向染料、小分子靶向染料、可激活靶向染料和雙模靶向染料(圖1)。

圖1 PSMA靶向NIRF染料結構示意圖

3.1 抗體PSMA靶向NIRF染料抗體PSMA靶向NIRF染料是指將全抗體或抗體片段偶聯NIRF染料構成的PSMA靶向NIRF染料。J591是1種PSMA靶向人源化單克隆抗體，其以良好的特異性最早應用于PSMA抗體靶向染料的合成。2011年，NAKAJIMA等[15]首先將J591抗體連接吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)，構建首個PSMA抗體靶向NIRF染料。但在該染料中，ICG連接于J591抗體后便發生熒光淬滅，只有在與PSMA陽性前列腺癌細胞結合并內化后才能再次發出熒光[15]。這種連接配體后易發生熒光淬滅的缺點限制了ICG在合成靶向熒光染料中的應用，但這一缺點在商業化NIRF染料IRDye800CW中得以克服。2016年，約翰斯·霍普金斯大學醫學院團隊MUKHERJEE等[16]首次將J591抗體連接NIRF染料IRDye800CW構建J591-IRDye800CW(又名ProstaFluor)，并且在PSMA+LMD前列腺癌細胞荷瘤裸鼠模型中證明該染料對PSMA+前列腺癌在注射后24～120 h具有良好的成像效果，且目前ProstaFluor已進入臨床試驗。同時，NAGAYA等[17]通過將PSMA單抗連接IR-700DX構建Anti-PSMA-IR700同時實現了NIRF成像和光熱治療的效果。

隨著近年來抗體技術發展，單鏈抗體等新抗體的研發也進一步推進了抗體PSMA靶向NIRF染料的發展。2016年，MAZZOCCO等[18]將PSMA單鏈抗體ScFvD2B連接于近紅外染料X770構建PSMA靶向NIRF染料X770-ScFvD2B，并順利用該染料對PSMA陽性前列腺癌細胞(LNCaP細胞)荷瘤鼠在靜脈注射后24～ 240 h進行體內成像。在另一項研究中，本課題組HAN等[19]從大型酵母展示單鏈抗體庫中篩選出一株人源PSMA單鏈抗體gy1并連接近紅外染料IRDye800CW構建首個人源PSMA單鏈抗體NIRF染料，并使用該靶向染料順利對PSMA+PC3前列腺癌細胞荷瘤鼠進行體內成像且取得較好效果。在此工作基礎上，研究人員進一步將單鏈抗體gy1構建為PSMA人源性全抗體PSMAb，將其連接至IRDye800CW上構建出PSMAb-IRDye800CW，它是首個靶向PSMA人源全抗體NIRF染料，同時該研究順利對PSMA+PC3前列腺癌細胞荷瘤鼠進行了體內成像[20]。

目前，抗體偶聯的NIRF探針在前列腺癌術中顯像具有獨特優勢，一方面是由于抗體代謝相對較慢，可在3～7 d達到術中成像的最佳信噪比，為手術提供了較為充裕的時間；另一方面是由于抗體分子量相對較大，主要經肝臟代謝而非腎臟代謝，其熒光在尿液中含量較少，避免了術中尿液滲漏導致的手術視野熒光污染。與PSMA靶向小分子配體相比，PSMA靶向抗體臨床試驗的進度相對較慢，在臨床試驗方面仍需努力。

3.2 小分子PSMA靶向NIRF染料小分子PSMA靶向NIRF染料是通過化學合成PSMA小分子化合物配體或抑制劑后偶聯NIRF染料構成的靶向染料。2005年，HUMBLET等[21]通過合成一種PSMA靶向小分子化合物GPI，并且連接四磺化七甲川吲哚菁綠類染料IRDye78構建首個小分子PSMA靶向近紅外染料GPI-78并順利將其用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞荷瘤鼠的體內成像。

Cy5.5和IRDye800CW等商業化NIRF染料的出現及使用促進了PSMA小分子靶向染料迅速發展。一項研究將PSMA小分子抑制劑CTT-54.2與NIRF染料Cy5.5連接構建成Cy5.5-CTT-54.2，其在體外實驗中顯示出對PSMA+前列腺癌細胞較強靶向性[22]。另一項研究通過合成一種PSMA靶向小分子抑制劑YC-27 3與IRDye800CW連接構建小分子PSMA靶向NIRF染料并且成功用于PSMA+前列腺癌PC3pip細胞荷瘤鼠模型體內成像[23]。此外，一項研究通過合成一種靶向PSMA小分子化合物PSMA-1，并將其分別與IRDye800CW和Cy5.5相連接，構建2種PSMA靶向近紅外染料，PSMA-1-IRDye800CW和PSMA-1-Cy5.5[24]。2種PSMA靶向熒光染料均在注射4 h后在對PSMA+PC3pip前列腺癌細胞荷瘤鼠進行活體成像中達到較好的成像效果[24]。另一項研究通過化學合成PSMA小分子抑制劑SCE(一種尿素化合物)并連接IRDye800CW構建PSMA靶向近紅外染料SCE-IRDye800CW，并用該染料順利對PSMA+LNCaP細胞荷瘤鼠進行體內成像[25]。

除IRDye800CW和Cy5.5外，一些新的NIRF染料也進入臨床前期研究。一項研究通過合成PSMA小分子抑制劑賴氨酸尿素谷氨酸鹽(Lysine-urea-glutamate，KUE)連接一種含鋅NIRF染料ZW800-1(zwitterionic fluorophores)并用KUE-ZW800-1成功對PSMA+前列腺癌LNCaP細胞荷瘤鼠進行體內成像[26]。同時，目前將PSMA靶向小分子配體KUE連接Cy5.5、Cy7、Cy7.5等陸續進入臨床前研究階段[26-27]。另一項研究設計PSMA靶向近紅外染料OTL78，該染料包括一個PSMA小分子配體DUPA和一種NIRF染料S0456，應用于PSMA+前列腺癌22Rv1和LNCaP細胞荷瘤鼠的體內成像并獲得信噪比5∶1的良好效果[28]。此外，還有研究將BODIPY熒光染料與PSMA小分子配體連接，構建PSMA靶向NIRF染料[29]。

近年來，小分子PSMA靶向NIRF染料的快速發展得益于以PSMA小分子配體為基礎的PSMA正電子發射型計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)在臨床中的快速應用和發展。但小分子配體分子量較小，主要經腎臟代謝，術中尿液滲漏可能導致的術野熒光污染問題有待進一步地研究。

3.3 可激活NIRF染料靶向染料具有“開關”效應，即平時保持關閉狀態不發出熒光，只有在與靶分子結合時才發出熒光。該染料利用靶分子酶活性，可在降低背景熒光的同時增加與靶分子結合熒光信號，以顯著提高信噪比[12]。由于PSMA具有葉酸水解酶和谷氨酸羧肽酶活性，因此可被設計為可激活NIRF染料的靶點。KAWATANI等[30]利用PSMA谷氨酸羧肽酶活性設計首個可激活PSMA靶向NIRF染料5GluAF-2MeTG。在5GluAF-2MeTG中，2MeTG是一種可以被PSMA的谷氨酸羧肽酶活性催化水解的底物，5GluAF是一種近紅外染料。當二者結合時2MeTG可通過最低未被占據分子軌道使5GluAF發生熒光淬滅，從而實現“關閉”熒光；在與PSMA結合后，PSMA谷氨酸羧肽酶活性將2MeTG解離，5GluAF重新發出強熒光從而實現“打開”熒光，以實現對PSMA+前列腺癌的成像。同時，另一項研究將前列腺癌PSMA靶向和腫瘤位置相對缺氧結合，合成了PSMA靶向與缺氧協同的多功能探針，用于前列腺癌的精準成像[31]。

3.4 多模態染料多模態染料是指將NIRF染料、核素等同時連接同一個配體從而實現同一靶向染料在多種成像方式下均可成像。由于每種成像方式都具有其自身獨特優勢和缺陷，因此同時組合多種成像方式有望結合多種成像方式的優勢，克服單一成像方式的缺陷。

有研究構建了可同時進行單光子發射計算機斷層成像術(SPECT/CT)和NIRF成像的PSMA靶向雙模態染料。一項研究通過合成一種PSMA靶向的新的化合物“1”并將其分別連接111In和IRDye800CW，構建了首個PSMA靶向的雙模態染料并成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[32]。另一項研究將PSMA胞外段結合的抗體D2B與111In和IRDye800CW連接構建了PSMA靶向雙模染料111In-DTPA-D2B-IRDye800CW，并將該染料成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞皮下荷瘤鼠模型和PSMA+LS174T前列腺癌細胞腹腔荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[33]。在靜脈注射111In-DTPA-D2B-IRDye800CW后48～168 h，NIRF成像可取得較高信噪比及較好成像效果[33]。同時，該課題組進一步嘗試IRDye700DX構建111In-DTPA-D2B-IRDye700DX用于PSMA靶向成像和光熱治療[34]。

一些研究構建可同時進行PET和NIRF成像的PSMA靶向雙模態染料。在已應用于前列腺癌患者診斷檢查的68Ga-PSMA-11 PET的基礎上，該研究分別將FITC、AlexaFluor488、DyLight800和IRDye800CW 4種熒光染料連接68Ga-PSMA-11，首次構建了4種可同時進行術前68Ga-PSMA PET和術中熒光手術導航的PSMA靶向雙模態染料[35]。其中68Ga-PSMA-11-DyLight800和68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 2種染料所使用熒光波段均為NIRF，更適合體內成像，且68Ga-PSMA-11-IRDye800CW在接種PSMA陽性LNCaP前列腺癌細胞荷瘤裸鼠中的信噪比更高，熒光成像效果更好[35]。因此該研究在大型動物實驗中，將68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 按照30 μg/kg注射給2只2～3月齡小豬，并在1 h后對它們順利使用達芬奇手術機器人進行NIRF引導下前列腺切除術，進一步驗證68Ga-PSMA-11-IRDye800CW應用于臨床的可行性[35]。鑒于68Ga-PSMA-11 PET/CT已在臨床中應用及IRDye800CW在臨床試驗中的廣泛應用，68Ga-PSMA-11-IRDye800CW有望快速向臨床應用進行轉化。

3.5 納米染料目前，隨著納米材料的快速發展，多個納米材料相關的PSMA靶向染料正在進行臨床前研究。一方面，有研究使用納米材料包裹ICG后在材料表面修飾PSMA靶向短肽從而實現ICG的PSMA靶向前列腺癌成像[36]；另一方面，有研究以聚乳酸-聚乙二醇納米顆粒為載體，通過表面修飾PSMA靶向肽，從而構建111In和IRDye800CW標記的雙模探針[37]。另外，研究人員還嘗試使用量子點熒光染料進行PSMA靶向成像，將J591抗體連接量子點近紅外染料Quantum dot 800并用該染料順利對PSMA+前列腺癌C4-2細胞荷瘤鼠進行體內成像[38]。但目前納米材料的潛在體內毒性等問題導致目前尚無PSMA靶向NIRF納米染料進入臨床試驗。

4 臨床試驗

目前已申請進入臨床試驗的PSMA靶向熒光染料有2項，均為PSMA抗體NIRF染料。一項為ProstaFluor，即HuJ591-IRDye800CW，由Spectros公司申請開展一期、二期臨床試驗(NCT01173146)。另一項為美國希望之城醫療中心申請的PSMA單克隆抗體MDX1201連接熒光染料A488用于ⅡB/Ⅲ/Ⅳ期前列腺癌患者的熒光引導下腹腔鏡前列腺癌根治術的臨床試驗(NCT02048150)。

5 挑戰與展望

近年來，PSMA靶向NIRF手術導航技術發展迅速，正處在由臨床前科研階段向臨床應用轉化的關鍵階段。隨著更多PSMA靶向染料研發和更多大規模臨床試驗開展，今后在手術中實時精準辨別前列腺癌與正常組織、轉移淋巴結和正常淋巴結將不再困難。可激活及多模態PSMA靶向近紅外染料有望進一步降低染料信噪比并不斷豐富靶向染料的功能。目前，近紅外Ⅱ區染料也在迅速發展，有望為熒光手術注入新的動力。我們相信隨著人們對靶向NIRF染料的不斷研究，前列腺癌PSMA靶向熒光手術導航技術將取得新的突破。