四環素誘導表達CARM1在乳腺癌細胞中的生物學效應

張 倩，陳濤琳，余 靂，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學生物學院，長沙 410082）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，按病理類型可分為浸潤性導管癌和非浸潤性導管癌。乳腺癌患者的治療成功率較低，腫瘤復發風險高，因而其預后較差，導致的死亡率也高。許多蛋白質精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）的表達水平和酶活性都在乳腺癌的發病過程中起著重要作用，調控著許多與乳腺癌的發生、發展有關的細胞通路。

共激活因子相關的精氨酸甲基轉移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，CARM1），又稱為蛋白質精氨酸甲基轉移酶4（protein arginine N-methyltransferase 4，PRMT4），屬于蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族［1］。作為 I型蛋白質精氨酸甲基轉移酶，CARM1能夠催化蛋白底物上的精氨酸，形成不對稱二甲基精氨酸［2］。CARM1可以通過多種機制激活轉錄，包括組蛋白H3甲基化［3］、輔助活化因子CBP/P300的甲基化［4］、染色質重構蛋白的招募［5］等，是哺乳動物體內不可或缺的一種酶［6］。已有研究顯示，CARM1在結直腸癌［7］、肺癌［8］、乳腺癌［9］等多種癌癥中異常表達，且與腫瘤發生、發展及不良預后相關［10］。近年來，CARM1在乳腺癌發生發展中的作用被廣泛研究。Morettin等［9］發現CARM1可以被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化，作為雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα）介導的轉錄激活的共激活因子。此外，Peng等［11］發現CARM1可與ER結合到染色質增強子區域，通過對底物蛋白高度甲基化來調控ER靶基因的轉錄，并促進乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和腫瘤發生。但CARM1在不同分型乳腺癌進展中的分子機制還尚未完全闡明。

四環素表達調控系統由Gossen等［12-13］建立，由轉錄調節因子、四環素反應性啟動子和四環素類抗生素三部分組成，包括tet-on基因調控系統和tetoff基因調控系統，具有高倍數誘導基因、可調控基因“開/關”等特點，是目前研究較多的基因表達系統之一。已有報道表明，經過不斷改進，四環素表達調控系統的應用已不僅僅局限于癌細胞系和轉基因動物，還可以應用于原代細胞，其應用范圍變得更加廣闊［14］。同時，該系統也為基因的表達與調控、基因的生物學作用研究提供了有效的研究方法。

本研究通過四環素操縱子系統構建可誘導表達CARM1的乳腺癌細胞株，為探索CARM1在乳腺癌中的生物學功能以及在乳腺癌發生發展中的相關機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細胞、HEK293T細胞儲存于湖南大學生物學院分子腫瘤學實驗室；感受態DH5α、金牌Mix酶購自北京擎科新業生物技術有限公司；慢病毒載體pVSVG、Δ8.91均來自于上海生博醫學生物工程科技有限公司；pLVX-TetOne-Puro載體購自優寶生物科技有限公司；AgeI、EcoRI限制性內切酶購自美國Thermo Scientific公司；Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自GIBCO公司；嘌呤霉素（puromycin）、多西環素（doxycycline，DOX）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；β-actin、CARM1抗體購自Cell Signaling Technology公司；BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

MDA-MB-231細胞與HEK293T細胞所用的培養基均為含10% FBS的DMEM完全培養基。細胞培養箱條件設置為37℃、5% CO2濃度、90%相對濕度。當HEK293T細胞密度達到80%進行轉染；當MDA-MB-231細胞密度達到70%進行慢病毒感染后獲得可由DOX誘導CARM1過表達的MDAMB-231細胞株（即231-pCARM1細胞）。在后續試驗中，用含10% FBS的DMEM完全培養基進行培養的細胞為對照組（即CARM1正常表達細胞），用含1 μg/mL DOX、10% FBS的DMEM完全培養基進行培養的細胞為試驗組（即CARM1過表達細胞）。

1.2.2 pLVX -TetOne-CARM1-Puro慢病毒載體的構建

以質粒pcDNA3.1-CARM1為模板，使用5′引物（CCGGACCGGTATGGCAGCGGCGGCGGCGGC）和3′引物（CCGGGAATTCCTAGCTCCCGTAGTGCATGGT）通過PCR進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及膠回收，得到CARM1片段，再使用AgeI、EcoRI限制性內切酶酶切CARM1片段，放置于37℃水浴鍋反應1 h，金屬加熱器85℃ 15 min使酶失活，4℃保存。載體使用AgeI、EcoRI限制性內切酶于37℃反應1 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及膠回收，得到酶切后pLVX-TetOne-Puro載體。將酶切后純化回收的載體和CARM1片段于22℃水浴鍋中過夜連接，反應體系為1 μL pLVX-TetOne-Puro、4 μLCARM1片斷、1 μL T4 DNA連接酶、2 μL T4 ligase buffer、12 μL ddH2O。取5 μL連接產物加入到50 μL DH5α感受態大腸桿菌中，置于冰上放置30 min，42℃熱激45 s，加入300 μL LB培養基，放入搖床，37℃、220 r/min活化細菌1 h，用移液槍吸取適量菌液進行涂板（含有氨芐青霉素的LB固體培養板），在37℃的細菌培養箱中正置30 min后倒置培養12～16 h。

1.2.3 pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒載體的鑒定

于LB固體培養板上挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，選取陽性克隆送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序鑒定。

1.2.4 慢病毒的包裝和感染

將pLVX-TetOne-CARM1-Puro（12 μg）與慢病毒包裝質粒 pVSVG（6 μg）、Δ8.91（9 μg） 共轉染HEK293T細胞，48 h后收集慢病毒上清；1 000 r/min離心5 min，取上清，用0.45 μm的過濾頭過濾，去除細胞碎片，獲得慢病毒溶液，分裝于1.5 mL EP管中，-80℃保存。選取生長狀態良好的乳腺癌MDAMB-231細胞，待密度至70%左右，將病毒與完全培養基按體積比為1∶1的比例混合均勻，加入培養皿中進行病毒感染；48 h后更換新鮮培養基，同時加入嘌呤霉素（1 μg/mL）進行篩選，持續7 d，將篩選得到的細胞進行擴大培養，得到受四環素誘導過表達CARM1的乳腺癌MDA-MB-231細胞株。

1.2.5 蛋白提取與蛋白質免疫印跡（Western blot）

細胞用預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，蛋白酶抑制劑與細胞裂解液按體積比為1∶100的比例加入培養皿；輕微搖晃均勻，冰上放置20 min，收集至1.5 mL EP管中，4℃下13 000 r/min離心10 min，收集上清，即為總蛋白。二喹啉甲酸試驗法（bicinchoninic acid assay，BCA）測定蛋白濃度。每孔上樣量為40 μg總蛋白質，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；轉印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；以含有Tween20的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）配制5%的脫脂牛奶封閉液進行封閉，室溫封閉1 h；4℃孵育一抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；4℃孵育二抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；顯影。

1.2.6 RNA提取與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

細胞用預冷的PBS洗3次，加入Triton裂解細胞，提取細胞中的總RNA。每個樣品取1 μg RNA進行逆轉錄反應以獲得細胞基因組cDNA。以cDNA為模板，加入DNA合成原料和引物進行RT-PCR。分別對CARM1cDNA以及3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的cDNA（內參）進行擴增，通過檢測不同反應體系中CARM1cDNA的熒光強度與GAPDHcDNA 的熒光強度的比值以計算不同樣品中CARM1mRNA的相對含量。試驗中使用的引物對如下：

CARM1-F：GCCATCCTGCAAAACCACA；

CARM1-R：CGGCAAAAAACGACAGGATC。

GAPDH-F：CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA；

GAPDH-R：GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC。

RT-PCR所使用的程序如下。1）預熱：95℃2 min；2）變性：95℃ 15 s；3）退火：55℃ 15 s；4）延伸 ：68℃ 20 s；5）重復步驟2～4，循環40次。

1.2.7 細胞增殖檢測

待細胞密度至90%以上，加入1 mL 20 μmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷類似物（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）溶液孵育2 h；去除培養基，加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min；去除多聚甲醛，加入1 mL PBS洗3 min，重復3遍；去除PBS，加入1 mL含0.3% Triton-100的PBS，孵育15 min；再加入1 mL PBS洗3 min，重復3遍；去除PBS，加入0.5 mL Click反應液，避光孵育30 min；加入1 mL PBS洗3 min，重復3遍；加入含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidi-no-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光淬滅封片液，室溫避光孵育15 min。置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 細胞周期檢測

待細胞長滿后，用PBS洗3遍，再用0.25%的胰酶消化，收集細胞于1.5 mL EP管中，4℃下1 000 r/min離心5 min；再用 PBS洗3遍，4℃下1 000 r/min離心5 min，去上清，加入500 μL 70%乙醇，吹打均勻，-20℃放置過夜；4℃下1 000 r/min離心5 min，去上清，加入適量PBS，進行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，PI與PBS體積比為1∶100，室溫避光孵育30 min；將細胞用300目篩網過濾至1.5 mL EP管內，上機檢測，所得數據使用軟件Flowjo V10進行分析。

1.2.9 細胞劃痕試驗

將細胞接種于6孔細胞培養板中，確保細胞密度在60%以上；待細胞長滿后，去除培養基，用200 μL無菌槍頭劃3條平行的劃痕，用PBS洗2遍。對照組加入2 mL新鮮培養基，試驗組加入2 mL含1 μg/mL DOX的培養基進行培養，每隔24 h進行拍照。

1.2.10 平板克隆試驗

將細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔細胞數為400個左右，加入1 mL新鮮培養基，待細胞完全貼壁后更換為2 mL新鮮培養基，之后觀察細胞狀態，每2 d更換1次培養基；14 d后吸去培養基，PBS洗3遍，每孔加入1 mL 0.1%結晶紫溶液染色30 min，再用PBS洗5遍。

1.2.11 UALCAN在線網站分析

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一個TCGA數據庫在線分析網站，簡單易操作。點擊TCGA Analysis，輸入目的基因CARM1（PRMT4），選擇不同類型的癌癥進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 在線網站分析CARM1與癌癥的相關性

利用UALCAN網站分析了CARM1與不同類型的癌癥之間的相關性，發現在結直腸癌（n=327）、肺癌（n=574）、乳腺癌（n=1 211）等癌癥中均存在CARM1表達異常（圖1）。這與之前的研究也是相一致的［7-9］，進一步表明了CARM1與癌癥之間的強相關性。

圖1 在線網站分析CARM1與各種癌癥的相關性Fig. 1 Analysis of the correlation between CARM1 and various cancers via an online website

2.2 pLVX-TetOne-CARM1-Puro質粒構建及病毒包裝

為了探索CARM1在癌癥中的生物學效應，我們制備了pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒質粒。首先，通過PCR擴增得到CARM1片段，條帶長度預計為1 800 bp左右。從圖2a中可以看到其條帶位置正確。用AgeI、EcoRI限制性內切酶雙酶切載體（圖2b），之后進行連接過夜、轉化、挑取單克隆進行菌落PCR鑒定（圖2c）。質粒圖譜如圖2d所示。選取狀態良好的HEK293T細胞，待細胞密度至70%～80%時進行轉染，48 h后收取病毒上清，離心后過濾，-80℃下分裝保存。

圖2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro質粒構建Fig. 2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro plasmid construction

2.3 誘導過表達CARM1乳腺癌MDA-MB-231細胞株的構建及鑒定

為了驗證CARM1對乳腺癌的發生、發展起著什么樣的作用，本文檢驗了乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中CARM1的表達量。結果如圖3a所示，MDA-MB-231細胞中CARM1的表達量遠遠低于MCF-7細胞，因此，我們選擇MDAMB-231細胞作為細胞模型。通過病毒感染、嘌呤霉素（1 μg/mL）篩選獲得四環素誘導過表達CARM1乳腺癌MDA-MB-231細胞株（圖3b）。提取蛋白和RNA進行Western blot檢測和RT-PCR分析，結果如圖3c和3d所示。與對照組相比，試驗組CARM1的表達量在蛋白水平和RNA水平都有明顯上升，說明誘導過表達CARM1的乳腺癌MDA-MB-231細胞株構建成功。

圖3 誘導表達CARM1乳腺癌MDA-MB-231細胞的驗證Fig. 3 Verification of induced expression of CARM1 in MDA-MB-231 cell

2.4 CARM1對乳腺癌MDA-MB-231細胞的生物學作用

在細胞鋪滿整個培養皿時進行細胞劃痕試驗，在0、24 h拍照記錄。結果發現：與未誘導的細胞相比較（圖4a1、4a2），加入DOX誘導24 h后的231-pCARM1細胞（圖4a3、4a4）遷移能力更強；使用結晶紫染色來觀察細胞克隆形成，發現與未誘導的細胞相比較，加入DOX誘導的細胞克隆形成能力更強（圖4b）；使用EdU-488細胞增殖試劑盒檢測細胞增殖，發現與未誘導的細胞相比較，誘導后的細胞增殖能力更強（圖4c）；利用流式細胞儀檢測細胞周期變化，發現與未誘導的細胞相比較，誘導后的細胞G1期細胞比率減少，S期和G2/M期的細胞比率增加，過表達CARM1能夠促進細胞周期的進程（圖4d）。這些結果表明，誘導過表達CARM1對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、克隆形成、遷移有一定的促進作用。

圖4 過表達CARM1促進了乳腺癌的遷移、克隆形成以及增殖Fig. 4 Overexpression of CARM1 promotes migration, clonal formation and proliferation of breast cancer

3 討論

乳腺癌是一種高度異質性的疾病，70%～80%未發生轉移的早期乳腺癌患者能夠得到治愈，而臨床上對于絕大多數已發生轉移的晚期乳腺癌患者則缺乏有效的治療手段［15］。2018全球癌癥報告顯示，乳腺癌在全球女性癌癥中的發病率和死亡率位居首位，且發病率仍在上升［16］。

PRMTs涉及許多細胞過程，包括轉錄、DNA修復、RNA代謝、信號轉導、蛋白質-蛋白質相互作用等［17］。CARM1催化精氨酸的甲基化修飾是一種翻譯后修飾，不論是在正常生理過程還是疾病中都發揮著不可忽視的作用。Shishkova等［6］發現了130多個CARM1的甲基化底物蛋白，且大多與癌癥相關。例如，中介體復合物亞基12（mediator complex subunit 12，MED12）在人類各種癌癥中頻繁發生突變，與轉錄調節相關，而CARM1可甲基化MED12，并與其表達呈現正相關性，二者高表達能夠顯著提高乳腺癌患者的總生存率和無病生存率［18］。另有研究證實，CARM1也可以甲基化組蛋白H3第17位的精氨酸，上調轉錄因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）的表達，進而促進腫瘤的生長與增殖［19］。與此一致的是CARM1過表達增加了細胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）的表達水平，促進了腫瘤的發生［20］。這些證據表明，CARM1的表達水平過高能夠促進腫瘤的發生與發展。

以上試驗結果表明，CARM1在乳腺癌細胞的增殖、遷移等過程中發揮著相當重要的作用，并可能借此參與乳腺癌的發生、發展以及轉移。然而，細胞水平的研究可能無法準確反映在人體內CARM1與乳腺癌之間的聯系。因此，在后續的研究過程中，本課題組將在個體水平上更深入地研究CARM1與乳腺癌發病機制之間的聯系，以期為乳腺癌的臨床干預提供新的治療靶點。