響應面法優化提取奶牛全混合日糧中總黃酮方法的研究

熊安然 潘予琮 余詩強 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

全混合日糧(TMR)是一種整合了粗料、精料、維生素等基本營養物質，能夠滿足奶牛生產需要的現代化飼喂技術。然而，動物飼糧既要滿足基本營養物質需要，還需要起到一定的生理調節和防御的作用[1]。飼糧中的黃酮、多酚等微量營養活性物質具有的激活動物自身免疫機能、提高體內抗氧化活性和飼料報酬等功能，成為后抗生素時代實現畜禽健康養殖的重要技術策略。占今舜[2]研究指出，添加苜蓿黃酮可提高奶牛采食量，促進營養物質的消化和乳糖合成；同時還可以提高奶牛的抗氧化能力及免疫能力。在飼糧中添加30 mg/kg大豆異黃酮可以提升奶牛的乳蛋白含量，改善乳品質[3]。因此，營養活性物質很有可能作為TMR中保障奶牛健康所需的關鍵因素，用以區別TMR的營養價值。

盧德勛[4-5]創立的系統動物營養學理論和技術體系，首次將飼糧營養活性物質主效因子測定和分析列入飼糧優化設計，然而當前在制定奶牛TMR配方時往往忽略了TMR中營養活性物質的作用效果，關于飼糧中微量黃酮是否會對奶牛的免疫、健康有促進作用也尚未有文獻報道，其中最主要的原因就是飼糧中黃酮類營養活性物質種類繁多，結構復雜，主效因子不明確，無法定量，從而制約了其在畜牧業中的廣泛應用。因此，對飼糧中營養活性物質的含量進行定性定量分析勢在必行。本研究選用了水浴和超聲2種常見提取黃酮的方法，運用響應面分析法(RSM)[6]優化奶牛TMR中總黃酮的最佳提取條件，為進一步研究其成分結構、生物活性、作用機制提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自首農集團北京奶牛中心良種場單產12 t以上的泌乳高產奶牛TMR，其組成及營養水平見表1；蘆丁標準品(≥98%)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁(AR，99.0%)、無水乙醇為分析純。其余試劑均為色譜級。

表1 TMR組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 儀器與設備

KQ500DE數控超聲波清洗器(功率500 W)；Multiskan FC型酶標儀；HH-8電熱恒溫水浴鍋；MD4100D實驗室雙級反滲透去離子水系統。

1.3 總黃酮的提取

稱取風干研磨后1.0 g奶牛TMR粉于錐形瓶中，在一定的條件下進行總黃酮的水浴提取或超聲提取，然后將得到的提取液抽濾，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶，備用。

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

配制一系列不同濃度梯度的蘆丁標準溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[7]，用酶標儀在510 nm的波長處測定吸光度，以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 奶牛TMR中的總黃酮的提取

參照秦晶晶等[8]對柿葉總黃酮提取工藝優化的方法，以乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取時間(40、60、80、100、120、140 min)、提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)為影響因素，研究各因素對水浴醇提及超聲提取奶牛TMR中總黃酮提取量的影響。

1.3.3 奶牛TMR總黃酮提取量的測定

準確量取樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照1.3.1中所述方法進行操作，按下式計算黃酮提取量：

式中：W表示黃酮提取量(mg/g)；c表示根據吸光度值計算出的溶液質量濃度(mg/mL)；D表示溶液稀釋倍數；M表示樣品取樣量(g)。

1.4 響應面試驗設計與統計分析

在單因素試驗結果基礎上，按照Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗。采用Excel 2007進行試驗數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

由圖1可知，對標準曲線進行擬合，得到蘆丁濃度(x)與吸光度(y)的關系的回歸方程：y=6.275 8x+0.038 7(R2=0.999 5)，線性關系極顯著，表明蘆丁溶液濃度在0～0.02 mg/mL,與吸光度線性關系良好。

2.2 水浴提取TMR中總黃酮的條件優化

2.2.1 不同提取條件下奶牛TMR中總黃酮的提取量

由圖2可知，奶牛TMR總黃酮提取量會受到乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間的影響，呈現先增后減的變化。通過單因素分析，最終確定最佳水浴醇提奶牛TMR總黃酮的條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶30，提取溫度為80 ℃，提取時間為80 min。這種條件下得到的總黃酮提取量最高，為9.15 mg/g。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.2.2 響應面試驗結果

以奶牛TMR中總黃酮提取量為響應值，選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)4因素3水平進行試驗設計，因素水平編碼見表2。采用響應面法優化奶牛TMR黃酮提取工藝，結果見表3，方差分析見表4。

對表3中奶牛TMR總黃酮提取量(Y)及4個影響因素進行二次回歸模型擬合，得到多元回歸模型：Y=9.22+0.66A-0.17B-0.15C+0.37D+0.20AB-0.19AC+0.087AD-0.62BC+0.074BD-0.27CD-1.44A2-0.82B2-0.68C2-0.57D2。方差分析結果見表4 。

圖2 不同提取條件下水浴萃取奶牛TMR中的總黃酮提取量

表2 因素水平編碼

表3 響應面分析方案及試驗結果

表4 響應面分析法方差分析

續表4方差來源Variance source平方和Sum of squares自由度Variance均方Mean squareF值F-valueP值P-valueAC0.1510.150.670.425 2AD0.0310.030.140.715 8BC1.5611.567.090.018 6?BD0.0210.020.100.758 2CD0.2810.281.290.275 1A213.37113.3760.92<0.000 1???B24.4014.4020.070.000 5??C22.9612.9613.480.002 5??D22.1312.139.720.007 6??殘差 Residual3.07140.22失擬項 Lack of fit2.42100.241.500.371 2純誤差 Pure error0.6540.16總和 Sum29.0728

由表4可知，失擬項P>0.05，差異不顯著，說明沒有失擬因素；結合模型P≤0.0001，差異極其顯著，可以看出模型擬合效果很好。根據F值可知，4個因素對TMR中總黃酮提取量的影響大小依次為：乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。

乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間交互作用對奶牛TMR總黃酮提取量影響的等高線圖與響應面3D圖見圖3。

根據圖3進行響應面分析，得到最優提取條件為：乙醇濃度82.6%、提取溫度80.37 ℃、提取時間75.11 min、料液比1∶34.05，此條件下奶牛TMR黃酮提取量預測值為9.396 3 mg/g。

2.3 超聲提取TMR中總黃酮的條件優化

2.3.1 不同提取條件下奶牛TMR中總黃酮的提取量

通過單因素分析，最終確定乙醇濃度為90%，料液比為1∶40，當提取時間為40 min時奶牛TMR總黃酮提取量最高，為10.97 mg/g(圖4)。

2.3.2 響應面試驗結果

總黃酮提取量為響應值，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)3因素3水平進行試驗

設計，因素水平編碼見表5。采用響應面法優化奶牛TMR黃酮提取工藝，結果見表6，方差分析見表7。

對表6中奶牛TMR總黃酮提取量及4個影響因素進行二次回歸模型擬合，得到多元回歸模型：Y=11.39+0.21A+0.71B-0.017C-0.17AB-0.47AC-0.87BC-1.97A2-0.46B2-0.76C2。方差分析結果見表7。

由表7可知，失擬項P>0.05，差異不顯著，說明沒有失擬因素；結合模型P≤0.05，差異顯著，可以看出模型擬合效果較好。根據F值可知，3個因素對TMR中總黃酮提取量的影響大小依次為：料液比>乙醇濃度>提取時間。

乙醇濃度、料液比、提取時間交互作用對奶牛TMR總黃酮提取量影響的等高線圖與響應面3D圖見圖5。

由圖5可知，響應面優化的最優提取條件為：乙醇濃度為90.34%、料液比為1∶49.84、提取時間為37.45 min，此條件下奶牛TMR黃酮提取量預測值為11.898 mg/g。

圖3 奶牛TMR總黃酮水浴萃取響應面分析等高線(A、B、C、D、E、F)及響應面(a、b、c、d、e、f)

3 討 論

黃酮是植物內生真菌產生的具有多種生物活性的次生代謝產物[9]，其化學成分、生物活性和含量會受到提取技術的強烈影響[10]。奶牛飼糧中的常規飼料，如苜蓿、燕麥常采用超聲輔助提取法[11-14]、復合酶解協同乙醇法[15]、微波提取法[11,16]、索氏提取法[17]、浸提法[18]對其中的總黃酮進行提取；而豆粕中的黃酮成分主要是大豆異黃酮，可采用超聲提取法[19]、加熱回流法[20]、微波提取法[21]、磁力攪拌法[22]等進行提取。采用不同的方法提取植物中的黃酮類營養活性物質，均會受到提取溶劑濃度、料液比、提取溫度和提取時間等多方面的影響。

圖4 不同條件下超聲提取奶牛TMR中的總黃酮含量

表5 因素水平編碼

表6 響應面分析方案及試驗結果

續表6編號No.乙醇濃度 Ethanol concentration/%(A)料液比 Material-liquid ratio (B)超聲時間 Extraction time/min(C)總黃酮提取量 Extraction amount of total flavonoids/(mg/g)10801∶30407.772 511901∶404011.209 212801∶50409.884 9131001∶40359.752 1141001∶50409.818 515901∶503511.279 016901∶304510.811 017801∶40358.223 6

表7 響應面分析法方差分析

外源添加植物黃酮對奶牛的生產性能、免疫等各方面具有積極的促進作用。王明等[23-25]將不同濃度的大豆異黃酮與淋巴細胞共育培養發現，添加低劑量(0.25～5.00 μg/mL)的大豆異黃酮能夠提高奶牛的免疫能力。李義等[27]和栗明月等[28-29]在竹葉黃酮對奶牛代謝、免疫及抗氧化方面的研究中發現，竹葉黃酮提高了熱應激奶牛的抗氧化能力。然而，除了黃酮類飼料添加劑，奶牛常規飼糧中的黃酮類營養活性物質也被證明具有抗菌、抗氧化、提高動物機體免疫機能等作用。王家皓等[15]對南苜蓿葉總黃酮的抑菌效果和抗氧化能力進行研究，發現其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，并且對羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均表現出一定的清除能力。同樣，許英一等[14]也通過試驗證明了苜蓿葉總黃酮在一定的質量濃度范圍具有較明顯的抗氧化活性，并隨著質量濃度的增加而增強。而王雙慧等[13]采用濾紙片法及牛津杯法探究燕麥黃酮的抑菌效果，數據顯示燕麥黃酮對大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、產酯酵母以及黑曲霉4種供試菌均有抑制作用，作用大小順序為大腸埃希氏菌>枯草芽孢桿菌>產酯酵母>黑曲霉，并且其抑制作用隨其濃度增大而增強。并且苜蓿黃酮還能夠上調奶牛乳體細胞中免疫和抗氧化相關基因的表達[30]。

圖5 超聲提取奶牛TMR總黃酮響應面分析等高線(A、B、C)及響應面(a、b、c)

根據本試驗研究結果，通過超聲提取奶牛TMR中的總黃酮最大提取量達到了干物質含量的1.13%(前期測出該飼糧干物質含量為97.4%)，比鈣、磷含量總和還要略高，因此飼糧中的微量活性物質很有可能具有潛在的重要作用。下一步研究可將提取工藝與HPLC等色譜技術結合，實現對飼糧中黃酮類物質的定性定量分析，從而探究不同提取方法或提取條件對奶牛TMR中總黃酮成分和含量的影響。對飼糧中的營養活性物質提取工藝進行優化，是研究這些微量成分的基礎，對于探究其生物學價值、優化飼糧配方將具有重要意義。

4 結 論

通過對響應值結果進行分析，得到奶牛TMR中總黃酮最佳提取工藝為：在乙醇濃度為90%，提取時間為40 min，料液比為1∶40的條件下，通過超聲提取到的總黃酮最大提取量為10.97 mg/g，該提取工藝可為奶牛TMR中總黃酮的進一步研究提供參考。