雞蛋葉酸含量檢測方法優化及其富集規律研究

白 彥 王 瑞,2 楊 玉* 李銳瑞 武笑天

(1.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801；2.呂梁學院生命科學系，呂梁 033000)

葉酸(folate)是指一類含有蝶酰谷氨酸結構的水溶性維生素，也稱為維生素B9、維生素H等，主要參與體內一碳單位代謝，與DNA合成、氨基酸轉化、甲酸代謝、組氨酸分解、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成及甲基化反應等有關，是生命體必需物質之一[1]。人體內沒有葉酸合成相關酶，需要通過食物或添加劑獲取葉酸。富含葉酸膳食主要有綠色蔬菜、豆類食品、酵母、動物肝臟、蛋黃等[2]。雞蛋營養豐富，氨基酸比例適合人體生理需求，是餐桌常見食物。功能性雞蛋主要通過調節微量元素、維生素、不飽和脂肪酸等在蛋雞飼糧中的科學配比進行飼喂而得到，其營養價值高于普通雞蛋。其中，富葉酸雞蛋在我國[3]及加拿大[4]、美國[5]、歐洲[6-7]等地得到廣泛研究和應用，但尚未有該產品的國標或行標來規范其生產。

雞蛋葉酸含量隨飼糧中葉酸添加量的增加而增加，但并非呈線性增加，而是存在飽和期，達到飽和期的飼糧葉酸添加量為2～16 mg/kg[3-6]。不同研究人員報道的雞蛋葉酸含量結果差異較大，普通雞蛋葉酸含量為17.5～35.0 μg/枚，富葉酸雞蛋為41～75 μg/枚，但總的來講，富葉酸雞蛋中葉酸含量為普通雞蛋的2～3倍[3-4,6,8-10]。這種差異可能與原料類型及來源、蛋雞品種及日齡、檢測方法等有關。多數研究持續時間為3～14周[3-11]，而蛋雞產蛋周期在50周以上；我國居民消費雞蛋多以“個”為單位，而雞蛋大小對全蛋葉酸含量有很大影響。因此，需要對全產蛋期雞蛋葉酸含量進行研究。

雞蛋中葉酸的主要形式為5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MTHF)，是人和動物體內的活性形式，且主要存在于蛋黃，蛋白中幾乎沒有[6,11]。食品中葉酸測定的國標法[12]規定，蛋類樣品葉酸提取采用高壓水解加酶解方法，檢測方法采用微生物法，但整個檢測過程至少需要5 d時間。酶解法是利用蛋白酶、淀粉酶等使葉酸從細胞中釋放出來，隨后利用大鼠血清等將多谷氨酸變成可檢測的單谷氨酸或去谷氨酸形式[13-15]。酶解處理并不是對所有樣品都適用，還可能會對測定結果有負面影響[16]。蛋黃中蛋白質、脂肪含量較高，超聲處理可降低其粒徑，增大溶解表面積，促進其溶解性[17]，是葉酸提取中常用的輔助方法。然而超聲可能對葉酸結構有一定的破壞[18-19]，需要嚴格控制時間。蛋黃葉酸主要與蛋白質結合[20-22]，高溫可以使蛋白質變性，從而使葉酸釋放于提取液中[18]，然而高溫可降低葉酸穩定性，需添加維生素C等進行保護[3]。微生物檢測法實驗室工作繁雜，標準范圍較窄，重復性較差，并不能準確評估食物中葉酸含量[23]。而高效液相色譜法檢測結果精確，分析速度快，操作步驟簡單，分離效果理想，逐漸成為主要的檢測手段[13,24]。針對葉酸檢測，紫外檢測器[24-25]和熒光檢測器[26-29]均有使用，但針對兩者性能比較的報道較少。

本試驗通過比較熒光檢測器和紫外檢測器的性能，研究超聲、高溫、酶解等提取方法對蛋黃葉酸含量檢測的影響，旨在優化改進基于高效液相色譜法測定雞蛋中葉酸含量的方法。通過短期篩選試驗，確定生產富葉酸雞蛋飼糧中葉酸的適宜添加量，隨后開展大群飼養的長期穩定性試驗，確定雞蛋葉酸含量到達高峰的時間及穩定性，為蛋雞1個生物學產蛋年生產穩定的富葉酸雞蛋提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5-MTHF(標準品)購自加拿大TRC公司；甲醇(色譜級)購自美國Fisher公司；抗壞血酸(純度99.0%)、巰基乙醇(純度99.0%)、蛋白酶(pepsin，1∶3 000)、大鼠血清購自北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶購自上海易恩化學技術有限公司；其他用于分離的試劑均為國產分析純；水為4.5 L規格娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀配置熒光檢測器和紫外檢測器以及Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)(美國安捷倫科技有限公司)、冷凍干燥機(美國GOLD-SIM公司)、恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、冷凍離心機(鹽城市安信實驗儀器有限公司)、組織勻漿儀(IKA T10 basic，德國IKA集團)、電子天平(BSA224S-CW，德國賽多利斯集團)。

1.3 高效液相色譜法檢測蛋黃中葉酸方法優化

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取10 mg 5-MTHF標準品，用提取液[14](0.1 mol/L 磷酸鹽溶液，含1%抗壞血酸、0.1%巰基乙醇，pH 6.1)溶解后定容到100 mL，配制成質量濃度為0.1 mg/mL標準品儲備液，-20 ℃保存。將標準儲備液稀釋到0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、5.00、10.00 μg/mL后存于棕色容量瓶中，現配現用，用于繪制標準曲線。

1.3.2 高效液相色譜參考條件

柱溫：35 ℃；進樣體積：20 μL；流速：0.4 mL/min；流動相A：甲醇；流動相B：pH 4.5、0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液；采用梯度洗脫[27]，如表1所示。熒光檢測條件：激發波長290 nm，發射波長360 nm[28]；紫外檢測條件：280、290 nm[25]。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 樣品準備

檢測體系構建使用普通京紅一號雞蛋的蛋黃凍干粉。具體為：蛋黃分離后，用濾紙小心擦干表面蛋清，混勻，于-80 ℃冰箱凍存1 d后，上機冷凍干燥48 h(冷阱溫度為-60 ℃，真空度為10 Pa)，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 提取方法優化

準確稱取0.5 g左右同一蛋黃凍干粉樣品于15 mL離心管中，加6 mL提取液，勻漿。之后以超聲、高溫、酶解等方法及其組合進行葉酸提取，每個處理進行6次重復，以選擇適宜提取方法。超聲、高溫、酶解提取的具體方法如下。

超聲提取：40 ℃、80 Hz。

高溫提取：90 ℃水浴5 min后在冰水中冷卻。

酶解提取采用“三酶法”，按文獻[12,15,30]提供的方法，略有改動，具體如下：加20 mg/mL蛋白酶溶液1 mL，37 ℃水浴3 h(每隔1 h搖勻1次)，沸水浴10 min后冰水冷卻至室溫，加20 mg/mL淀粉酶溶液1 mL、大鼠血清0.3 mL，37 ℃水浴22 h，沸水浴10 min后冰水冷卻至室溫。

樣品經提取處理后，用提取液定容到10 mL，12 000×g、4 ℃離心25 min后取上清液，過0.22 μm濾膜，上機檢測。整個過程需要避光操作。

1.3.5 方法驗證

從太谷區某超市購買白殼、粉殼和褐殼雞蛋，烏雞蛋等不同類型雞蛋各10枚，將每枚雞蛋的蛋黃分離后，立即用上述優化方法對新鮮蛋黃中葉酸進行檢測。

1.4 葉酸富集規律試驗設計

試驗在太谷區興民牧業有限公司進行。添加劑葉酸(純度99.8%)為河北某生物科技有限公司生產。

試驗雞舍為半封閉式，采用階梯式籠養模式，每籠3只蛋雞，試驗期間自由采食和飲水，每日光照16 h，強度不少于15 lx/m2。

1.4.1 適宜添加量篩選試驗

采用單因素試驗設計，挑選初始體重一致的健康30周齡京紅一號蛋雞648只，隨機分為6組，每組6個重復，每個重復18只。對照組飼喂基礎飼糧(表2)，試驗組在基礎飼糧中分別添加1、3、6、12、24 mg/kg葉酸。第5周最后1天每個重復隨機取10枚雞蛋，將其蛋黃混勻于-80 ℃冰箱保存，進行葉酸含量檢測。

表2 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表2項目 Items含量 Content營養水平 Nutrient levels3)代謝能 ME/(MJ/kg)11.08粗蛋白質 CP16.46粗纖維 CF3.00粗脂肪 EE2.89粗灰分 Ash12.61鈣 Ca3.51總磷 TP0.50有效磷 AP0.22賴氨酸 Lys0.78蛋氨酸 Met0.39蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.66蘇氨酸 Thr0.58葉酸 Folate/(mg/kg)0.35

1.4.2 富葉酸雞蛋葉酸含量的長期穩定性研究

根據1.4.1結果，選擇16 000羽蛋雞舍，從20周齡起，在蛋雞飼糧中添加7.5 mg/kg葉酸，至60周齡。在雞舍內選擇10個監測點，兼顧雞舍上、下，前、后，南、北等。分別于20、21、22、23、24、25、27、29、33、37、41、46、50、55、60周齡09:00—10:00，每個檢測點取10枚雞蛋，稱重后，分離蛋黃與蛋清，蛋黃稱重混勻后立即進行葉酸含量檢測。

1.5 數據與分析

數據使用SPSS 26.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進行組間多重比較和差異顯著性分析。方法優化數據以平均值和標準差表示，葉酸富集數據以平均值和總體標準誤表示。回歸分析以葉酸添加量為變量，全蛋葉酸含量為因變量，進行線性、二次、三次等曲線估算。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 檢測器性能比較與選擇

以標準液葉酸含量為橫坐標(X)，所對應熒光檢測器、紫外檢測器峰面積(重復進樣3次的平均值)為縱坐標(Y)分別進行標準曲線繪制。將濃度為0.10 μg/mL的標準溶液，按1.3.2中的色譜條件測試3次，信噪比為10∶1時的相應濃度為定量限(LOQ)，信噪比為3:1時的相應濃度為檢出限(LOD)。按照1.3.2中色譜條件，連續10 d，每天檢測1次1 μg/mL標準液，記錄峰面積、峰高、半峰寬，比較檢測器檢測結果的穩定性，如表3所示。結果顯示，在0～10 μg/mL，熒光檢測器、紫外檢測器280 nm和紫外檢測器290 nm這三者所得標準曲線的相關系數均達到0.999。熒光檢測器峰面積和峰高均極顯著高于紫外檢測器(P<0.01)，約是紫外檢測器的3.5倍。紫外檢測器在290 nm時峰面積極顯著高于在280 nm時(P<0.01)，兩者峰高無顯著性差異(P>0.05)。三者半峰寬無顯著差異(P>0.05)。熒光檢測器的檢出限和定量限遠低于紫外檢測器，表明其靈敏度更高。后續試驗選用熒光檢測器。

2.2 提取方法對檢測結果的影響

由表4可知，樣品勻漿后未進行任何處理和采用B提取方法未檢出蛋黃葉酸。只對C～G提取方法進行分析，結果顯示：蛋黃葉酸含量檢測值以D提取方法最高，C提取方法次之，再次為E提取方法，F和G提取方法最低。C和D提取方法的檢測值顯著高于F和G提取方法(P<0.05)。后續試驗選用D提取方法，即超聲5 min后90 ℃水浴5 min進行蛋黃葉酸提取，隨后及時檢測。5-MTHF標準品和蛋黃樣品色譜圖如圖1所示。

表3 檢測器性能比較

表4 提取方法對檢測結果的影響

圖1 5-MTHF標準品和蛋黃樣品色譜圖

2.3 精密度、回收率和穩定性

用2.1和2.2中確定的方法，檢測同一蛋黃凍干粉樣品中葉酸含量，并在樣品中加1 μg 5-MTHF標準品，進行回收率測定，重復測定8次，結果如表5所示。樣品回收率平均為98.01%，相對標準偏差(RSD)為4.42%，同一樣品檢測結果RSD為2.15%。上述結果表明優化的檢測方法精密度和回收率均能滿足檢測要求。

表5 精密度與回收率試驗

由于樣品處理與檢測不能完全同步，隨后進行了穩定性試驗。樣品提取后立即檢測(0 d)以及1、2 d(4 ℃保存)后進行檢測，每次3個重復。由表6可知，連續3 d的檢測結果差異很小，穩定性較高。

表6 穩定性試驗

2.4 方法驗證

對市場常見的雞蛋類型蛋黃葉酸含量進行檢測，用于驗證方法可行性，結果如表7所示。

2.5 雞蛋中葉酸富集規律

由表8可知，蛋雞飼糧中添加葉酸1～24 mg/kg可以極顯著提高蛋黃和全蛋葉酸含量(P<0.01)，但并非隨著飼糧葉酸添加量的增加而直線上升，在6～12 mg/kg組達到最高值后，在24 mg/kg組呈現下降的趨勢。本試驗中，葉酸添加量為3～24 mg/kg的4個組的蛋黃葉酸及全蛋葉酸含量無顯著差異(P>0.05)，但6 mg/kg組全蛋葉酸含量比3 mg/kg組提高8.5%，與12 mg/kg組差異很小，考慮到生產成本問題，需在理論上估測生產富葉酸雞蛋的蛋雞飼糧葉酸適宜添加量。

對全蛋葉酸含量進行回歸分析，結果如表9所示。結果顯示，在0～24 mg/kg葉酸添加量范圍內，全蛋葉酸含量對飼糧葉酸添加量的響應呈二次和三次曲線變化，且三次曲線的決定系數高于二次曲線，因此選擇三次曲線的回歸模型計算雞蛋中葉酸富集量最高時對應的蛋雞飼糧葉酸添加量，確定7.5 mg/kg為適宜添加量。

表7 常見蛋類葉酸含量

2.6 富葉酸雞蛋在蛋雞產蛋期葉酸含量穩定性

從20周齡產蛋開始，在基礎飼糧中添加葉酸7.5 mg/kg，至60周齡，定期檢測雞蛋葉酸含量，測定結果如圖2所示。結果顯示，蛋黃葉酸含量在23周齡趨于穩定，在25周齡達到最高值，在25～60周齡，蛋黃葉酸含量有較小波動，且隨著日齡增加，略有下降，但整體保持在5 μg/g以上。全蛋葉酸含量隨著日齡的增加而增加，在33周齡以后，蛋重和蛋黃重增加幅度較小，全蛋葉酸含量基本穩定，即每個雞蛋可提供85 μg以上的葉酸。

表8 飼糧中添加葉酸對雞蛋葉酸含量的影響

表9 全蛋葉酸含量與飼糧葉酸添加量的回歸模型

圖2 生產周期內富葉酸雞蛋蛋重、蛋黃重及葉酸含量

3 討 論

3.1 檢測條件及提取方法的優化

葉酸本身具有熒光性[14]，不需要任何衍生方法即可用熒光檢測器進行檢測，具備更低的檢測限[16]，干擾峰較少[27]。葉酸在紫外210～300 nm均有吸收，在280[24]和290 nm[25]峰形較好、檢測靈敏度高。本試驗中，熒光檢測器在檢出限、定量限、峰型等方面均優于紫外檢測器。試驗過程中，蛋黃樣品檢測液中葉酸含量在0.125 μg/mL以上，遠高于熒光檢測器的定量限，滿足檢測要求。

對蛋黃樣品只進行超聲處理時不能達到檢出限，表明超聲處理雖然能夠使提取液與樣品更好地接觸，但不能釋放葉酸。本試驗中，超聲10 min后高溫提取的檢測結果低于超聲5 min，表明超聲可能對葉酸結構有一定的破壞[18-19]，因此需要嚴格控制超聲時間。酶解處理也能釋放葉酸，而本試驗中酶解處理后的檢測結果顯著低于高溫處理，可能與樣品中干擾物質有關，使葉酸沒有完全釋放[16]，也可能與處理時間較長使少量葉酸氧化降解有關。

Hoey等[6]利用微生物法測得雞蛋中葉酸含量為0.60 μg/g，折合到1個雞蛋(蛋重50～70 g)為30～40 μg；Jastrebova等[31]利用高效液相色譜法測得蛋黃中葉酸含量為2.26 μg/g，折合到1個雞蛋(蛋黃重15～20 g)為35～45 μg/枚；梁敏慧[15]利用液質聯用(LC-MS)法測得雞蛋中葉酸含量為0.823 μg/g，折合到1個雞蛋為41～57 μg；楊艷[3]利用LC-MS法測得雞蛋中葉酸含量約為36 μg/枚。本試驗利用優化的方法測得不同類型雞蛋中葉酸含量有差異，可能與蛋雞品種、飼糧組成、葉酸添加等有關，但總體在39～49 μg/枚，與前人研究結果基本一致，說明方法可行。此方法準確性高，與國標法[12]相比，操作簡單，檢測時間縮短。

3.2 生產富葉酸雞蛋飼糧葉酸適宜添加量及生產周期內雞蛋葉酸含量的穩定性

飼糧中添加的葉酸經腸道吸收后，在腸上皮細胞經二氫葉酸還原酶的作用轉化為四氫葉酸后經門靜脈進入肝臟，轉化為各種形式參與機體物質代謝，其中5-MTHF從肝細胞進入血液后，隨血液循環到機體各個組織器官發揮重要作用。5-MTHF轉運至雞卵巢后，經胞吞作用進入卵黃而達到富集作用[2]。已有研究顯示，雞蛋中葉酸含量隨著飼糧中葉酸添加量的增加而增加，但到達一定量后不再增加[3-8,11]，與本試驗結果一致。葉酸在腸道吸收受到限制可能是導致雞蛋中葉酸含量存在平臺期的一個因素[32]。不同品種蛋雞對葉酸的敏感度可能不同。白萊航雞飼糧中添加2 mg/kg葉酸時，蛋黃葉酸含量達到飽和[5]；海蘭W36、海蘭W98、海蘭CV20生產富葉酸雞蛋時，飼糧中葉酸適宜添加量均為4 mg/kg[3-4,33]；海蘭褐蛋雞飼糧中添加16 mg/kg葉酸時雞蛋葉酸含量最高，且達到平臺期[6]。本試驗以京紅蛋雞為研究對象，蛋黃葉酸含量在飼糧葉酸添加量為3 mg/kg時趨于飽和，在葉酸添加量為6 mg/kg時達到最高。但為追求最大生產效益，根據統計學分析結果，選擇7.5 mg/kg作為生產富葉酸雞蛋的飼糧葉酸適宜添加量。蛋黃自形成到從卵巢排出需要10 d左右，因而蛋黃中葉酸富集并達到平衡需要一定時間。Hoey等[6]研究顯示，飼糧添加葉酸第3周，雞蛋葉酸含量達到飽和；Dickson等[33]研究表明，蛋雞高峰期(25～28周齡)飼喂添加4 mg/kg葉酸飼糧4周后，全蛋及蛋黃葉酸含量達到最高值，隨后每8周進行1次檢測(共5次)的結果差異較小，與本試驗結果基本一致。33周齡后每枚雞蛋可提供葉酸85 μg以上，根據國家衛生健康委員會推薦的居民膳食營養素參考攝入量[34]計算，可滿足幼兒至正常成人葉酸推薦量的50%～20%。

4 結 論

① 基于高效液相色譜法對葉酸含量進行檢測，熒光檢測器性能優于紫外檢測器。蛋黃葉酸的提取方法以超聲5 min后90 ℃水浴5 min效果最好。

② 從20周齡起在京紅蛋雞飼糧中添加7.5 mg/kg葉酸，23周齡后蛋黃葉酸含量保持在5 μg/g以上，33～60周齡全蛋葉酸含量保持在85 μg/枚以上。