植物炭黑對采食玉米赤霉烯酮污染飼糧的大鼠生長性能和生殖系統(tǒng)的影響

劉淑杰 鄧 波 吳 杰 徐子偉 馬倩倩

(浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產生的一種真菌毒素，又稱F-2毒素，為一種二羥基苯甲酸內酯類植物雌激素，具有強烈的生殖毒性、細胞毒性、免疫毒性和致癌毒性等[1]。ZEN最初從患有赤霉病的玉米中分離獲得，是玉米、大麥、燕麥、高粱和小米等中最常見、威脅力最大的污染霉菌毒素之一，會給動物及人類健康造成嚴重的安全隱患，并給畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。ZEN化學結構與內源性雌激素有高度的相似性，具有強烈的雌激素效應，其通過食物鏈被人或動物攝入體內，可競爭性與內源性雌激素受體結合，并迅速激活雌激素的反應元件，造成人或動物繁殖機能異常，生殖系統(tǒng)受到不同程度損傷，甚至導致死亡[2]。研究顯示，ZEN能夠引起雌性動物生殖激素分泌紊亂，促進卵巢顆粒細胞凋亡[3]，抑制卵母細胞成熟，導致子宮內膜增生[4]、乳腺增大和排卵不規(guī)律等，甚至造成假性懷孕及死胎等[5]。ZEN可導致雄性動物精子質量和活力下降以及睪丸萎縮等[6]。另外，ZEN還會損害肝臟和腎臟等組織，導致免疫功能下降[7]。

在世界范圍內，ZEN污染非常廣泛和普遍，其化學性質穩(wěn)定，難以在谷物加工過程中被降解，因此，研究安全、高效的脫毒方法勢在必行。在飼料行業(yè)中，常采用霉菌毒素吸附劑(如活性炭、沸石和蒙脫石等)的方法進行脫毒，盡管市場上銷售的吸附劑種類繁多，但是對ZEN吸附性能差異較大，產品質量不穩(wěn)定[8]。植物炭黑是一種在我國使用量較大的天然食品色素，由植物不完全燃燒產生，無毒，且具有不參與人體代謝等優(yōu)點。植物炭黑另一顯著特性是微孔結構多，比表面積大，對有毒有害物質、病原微生物(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂毒素和大腸桿菌等)或重金屬等都具有很強的吸附力，是一種非常有前景、安全的霉菌毒素吸附劑[9-10]。然而，植物炭黑尚未應用于畜禽生產中，直至2020年1月14日，國家農業(yè)農村部公告第258號文件頒布，批準由福建省順昌碳娃娃生物科技有限公司和福建省百草霜生物科技有限公司聯(lián)合申請的植物炭黑作為新飼料添加劑，這為植物炭黑用于畜牧領域的研究及應用拉開了序幕。鑒于此，本試驗首次開展植物炭黑對飼喂ZEN污染飼糧的大鼠生長抑制、肝臟和生殖系統(tǒng)損傷的緩解效果研究，并確定植物炭黑適宜添加劑量，為將植物炭黑應用于飼料行業(yè)和畜禽生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZEN[美國化學文摘社(CAS)編號17924-92-4]購自加拿大TripleBond公司，植物炭黑由福建省百草霜生物科技有限公司提供。堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、尿素氮(UN)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、促黃體素(LH)和催乳素(PRL)檢測試劑盒(編號分別為A059-2-2、C009-2-1、C010-2-1、C013-2-1、H101-1-2、H102-1-2、H206-1-2和H905)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，選用64只體重約為150 g的5～6周齡無特定病原體(SPF)級雌性SD大鼠(購自浙江省醫(yī)學科學院)，隨機分為4個組，每組16個重復，每個重復1只。4個組分別為：1)空白對照組，飼喂基礎飼糧；2)負對照組，飼喂基礎飼糧+25 mg/kg ZEN；3)低劑量植物炭黑組，飼喂基礎飼糧+25 mg/kg ZEN+1.0 g/kg植物炭黑；4)高劑量植物炭黑組，飼喂基礎飼糧+25 mg/kg ZEN+1.5 g/kg植物炭黑。試驗預試期7 d，正試期28 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

大鼠單籠飼養(yǎng)，籠底墊上碎木屑，每隔2 d更換1次墊料，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2) ℃、相對濕度為40%～70%，光照周期為12 h明亮和12 h黑暗，氨氣濃度≤14 mg/mL，大鼠自由采食和飲水。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 生長性能

在正試期第1、14和28天08：00，對所有試驗大鼠空腹稱重，每天記錄每只大鼠的給料量和剩料量，計算試驗各階段大鼠平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指標及激素水平

分別于正試期第14和28天，對所有試驗大鼠于眼眶下靜脈采血，在4 ℃條件下放置12 h，于3 000 r/min離心15 min，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎萌詣由治鰞x檢測血清ALP、GPT和GOT活性以及UN濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清FSH、E2、LH和PRL濃度。

1.4.3 卵巢病理學檢測

分別于正試期第14和28天，每組隨機取8只大鼠，將大鼠安樂死，迅速剖開腹腔，取出右側卵巢，然后將卵巢放入10%中性甲醛溶液中，樣品經石蠟包埋后切片，再經蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)結構，用于組織病理學分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠生長性能的影響

由表1可知，第1～14天，與空白對照組相比，負對照組大鼠ADG顯著降低(P<0.05)，降低了26.06%；F/G顯著升高(P<0.05)，升高了33.08%。與負對照組相比，低劑量植物炭黑組大鼠ADG和F/G差異不顯著(P>0.05)，而ADG顯著低于空白對照組(P<0.05)，降低了21.28%。與空白對照組和負對照組相比，高劑量植物炭黑組大鼠ADG和F/G差異不顯著(P>0.05)。第15～28天，與空白對照組相比，負對照組大鼠F/G極顯著升高(P<0.01)，升高了28.21%；與空白對照組和負對照組相比，低劑量植物炭黑組大鼠F/G差異不顯著(P>0.05)；與負對照組相比，高劑量植物炭黑組大鼠F/G顯著降低(P<0.05)，降低了15.90%，而與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)；各組間ADG差異不顯著(P>0.05)。從全期(第1～28天)來看，與空白對照組相比，負對照組大鼠ADG極顯著降低(P<0.01)，降低了28.45%；F/G極顯著升高(P<0.01)，升高了40.73%。與負對照組相比，低劑量植物炭黑組大鼠ADG和F/G差異不顯著(P>0.05)，而ADG顯著低于空白對照組(P<0.05)，降低了20.69%。與負對照組相比，高劑量植物炭黑組大鼠F/G顯著降低(P<0.05)，降低了20.89%，ADG差異不顯著(P>0.05)；而與空白對照組相比，ADG和F/G差異均不顯著(P>0.05)。試驗期間，各組間ADFI差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠血清生化指標的影響

由表2可知，第14和28天，與空白對照組相比，負對照組大鼠血清ALP活性極顯著升高(P<0.01)，分別升高了37.67%和44.17%；而低劑量植物炭黑組大鼠血清ALP活性與其他各組之間差異均不顯著(P>0.05)。第14天，高劑量植物炭黑組大鼠血清ALP活性極顯著低于負對照組(P<0.01)，降低了22.48%，而與空白對照組和低劑量植物炭黑組之間差異不顯著(P>0.05)。第28天，高劑量植物炭黑組大鼠血清ALP活性與其他各組之間差異均不顯著(P>0.05)。第14天，各組間大鼠血清GPT活性差異均不顯著(P>0.05)。第28天，與空白對照組相比，負對照組大鼠血清GPT活性顯著升高(P<0.05)，升高了42.55%；高劑量植物炭黑組大鼠血清GPT活性顯著低于負對照組(P<0.05)，降低了24.48%，而與空白對照組和低劑量植物炭黑組之間差異不顯著(P>0.05)；低劑量植物炭黑組大鼠血清GPT活性與其他各組之間差異均不顯著(P>0.05)。第14天，各組間大鼠血清GOT活性差異均不顯著(P>0.05)。第28天，負對照組大鼠血清GOT活性極顯著高于空白對照組(P<0.01)，升高了37.75%；高劑量植物炭黑組大鼠血清GOT活性顯著低于負對照組(P<0.05)，降低了20.27%，而與空白對照組和低劑量植物炭黑組之間差異不顯著(P>0.05)；低劑量植物炭黑組大鼠血清GOT活性與其他各組之間差異均不顯著(P>0.05)。第14和28天，各組間大鼠血清UN濃度差異均不顯著(P>0.05)。

表1 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠生長性能的影響

表2 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠血清生化指標的影響

2.3 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠卵巢組織形態(tài)的影響

由圖1可知，HE染色結果顯示，第14和28天，空白對照組大鼠卵巢結構清晰，皮質部和髓質部可見，皮質部內有較多不同發(fā)育程度的原始卵泡、初級卵泡和初級卵母細胞，髓質部的血管清晰可見。第14天，負對照組大鼠卵巢結構存在，但皮質部可見萎縮，原始卵泡、初級卵泡和初級卵母細胞明顯較空白對照組減少，髓質部的血管少見，且第28天卵巢髓質部萎縮和血管充血更為明顯。第14和28天，低劑量植物炭黑組和高劑量物炭黑組大鼠卵巢組織形態(tài)較負對照組明顯改善。

圖1 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠卵巢組織形態(tài)的影響

2.4 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠血清生殖激素水平的影響

由表3可知，第14天，負對照組和低劑量植物炭黑組大鼠血清FSH濃度極顯著高于空白對照組(P<0.01)，分別升高了20.40%和26.53%；高劑量植物炭黑組大鼠血清FSH濃度極顯著低于負對照組(P<0.01)，降低了28.94%，而與空白對照組相比差異不顯著(P<0.05)。第28天，負對照組大鼠血清FSH濃度顯著高于空白對照組(P<0.05)，升高了19.86%；高劑量植物炭黑組大鼠血清FSH濃度顯著低于負對照組(P<0.05)，降低了19.38%，而與空白對照組和低劑量植物炭黑組之間差異不顯著(P>0.05)。第14天，負對照組和低劑量植物炭黑組大鼠血清E2濃度極顯著低于空白對照組(P<0.01)，分別降低了19.30%和15.17%；高劑量植物炭黑組大鼠血清E2濃度極顯著高于負對照組(P<0.01)，升高了29.98%，而與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。第28天，負對照組大鼠血清E2濃度極顯著低于空白對照組(P<0.01)，降低了17.59%；高劑量植物炭黑組大鼠血清E2濃度極顯著高于負對照組(P<0.01)，升高了31.50%，且顯著高于空白對照組和低劑量植物炭黑組(P<0.05)。第14天，負對照組大鼠血清LH濃度極顯著低于空白對照組(P<0.01)，降低了46.74%；低劑量植物炭黑組和高劑量植物炭黑組大鼠血清LH濃度極顯著高于負對照組(P<0.01)，分別升高了35.20%和71.94%；而高劑量植物炭黑組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。第28天，負對照組、低劑量植物炭黑組和高劑量植物炭黑組大鼠血清LH濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，分別降低了25.63%、26.71%和23.10%，且負對照組、低劑量植物炭黑組和高劑量植物炭黑組大鼠血清LH濃度之間差異不顯著(P>0.05)。第14和28天，各組間大鼠血清PRL濃度差異均不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠生長性能的影響

關于ZEN對動物生產性能的影響報道結果并不一致。研究顯示，給雞灌服ZEN的劑量高于5 mg/kg時可降低蛋雞的生產性能[11]。給妊娠期母鼠(大鼠)飼喂含有20 mg/kg ZEN的飼糧可顯著降低母鼠體重和ADG，并顯著降低ADFI[12]。飼糧添加0.5～1.5 mg/kg ZEN對斷奶仔豬ADG、ADFI和F/G均無影響，但是隨ZEN添加劑量的提高F/G呈一次線性降低的趨勢[13]。而Gajecka等[14]報道，長期給予低劑量的ZEN能夠增加小母豬體增重。這些研究說明ZEN對生長性能的影響與給予ZEN的劑量、給予持續(xù)時間、動物品種和動物所處的生理階段都密切相關，不過總得來說，高劑量ZEN能夠降低動物生產性能。在本研究中，飼糧中添加25 mg/kg ZEN極顯著降低了大鼠試驗全期ADG，極顯著提高了F/G；顯著降低了大鼠第1～14天的ADG，顯著提高了F/G；以及極顯著提高了第15～28天的F/G。這說明給予高劑量的ZEN顯著降低了大鼠的生長性能，這也進一步證實了上述的觀點，而且這種影響對試驗前半期更為顯著。

表3 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠血清生殖激素水平的影響

在本研究中，飼糧添加植物炭黑能夠在一定程度上緩解ZEN所致的大鼠生長性能的降低。與負對照組相比，飼糧添加高劑量植物炭黑分別提高了試驗各階段的ADG，顯著降低了第15～28天和第1～28天的F/G，并與空白對照組相比差異不顯著。由于尚未有植物炭黑在畜禽方面的研究報道，所以未能進行相關研究比較。研究顯示，在含有3 mg/kg ZEN的飼糧中添加0.2%沸石吸附劑對斷奶仔豬的生長性能無顯著影響[15]。向低于飼料衛(wèi)生標準ZEN水平的飼糧中添加凹凸棒石吸附劑，對蛋雞的生產性能無顯著影響，但具有一定程度的改善作用[16]。姚寶強等[17]研究表明，飼糧中含有1 mg/kg ZEN可顯著提高斷奶仔豬ADG，但對ADFI和F/G無影響，而飼糧中添加吸附劑(主要為高性能鈣蒙脫石、蛋白石-C和石英)對生長性能無影響。在本試驗中，在ZEN污染的飼糧中添加低劑量植物炭黑對大鼠生長性能無顯著改善作用，而添加高劑量植物炭黑可有效吸附ZEN，降低機體內發(fā)揮毒性作用的ZEN劑量，從而提高大鼠ADG，顯著降低F/G，緩解ZEN對大鼠生長的抑制作用。

3.2 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠肝臟功能的影響

肝臟是ZEN代謝的主要場所，ZEN主要代謝生成α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)或β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)，α-ZOL比ZEN具有更強的雌激素活性，對肝細胞具有強烈的毒性作用[18]。血液中ALP、GPT和GOT活性變化被認為是衡量肝臟健康的重要指標，當肝臟受損時，肝細胞通透性增加，細胞內ALP、GPT和GOT釋放進入血液，導致血液中酶的活性升高。研究顯示，飼喂含有1.6 mg/kg ZEN的飼糧可顯著提高初情期前的母豬血液GOT活性[19]；飼喂含有1.0 mg/kg ZEN的飼糧能夠顯著提高斷奶仔豬血液GOT活性[20]；每周給予大鼠腹腔2 mg/kg BW劑量的ZEN可提高血清GPT和ALP活性[21]。本研究結果顯示，ZEN極顯著提高了大鼠第14和28天血清ALP活性，顯著或極顯著提高了第28天血清GPT和GOT活性，說明ZEN對肝臟產生毒性作用，造成了肝細胞的損傷。姚寶強[22]研究表明，在飼糧中添加霉菌毒素吸附劑能夠顯著降低由ZEN引起的仔豬血清ALP、GPT和GOT活性升高。王歡歡等[23]研究表明，飼糧中添加0.3 mg/kg殼聚糖硒未能顯著降低由ZEN引起的斷奶仔豬血清GPT和GOT活性升高，但是有降低趨勢。李守杰等[24]報道，在ZEN污染飼糧中添加膨潤土對斷奶仔豬血清GPT和GOT活性升高無顯著影響。本研究結果表明，在ZEN污染的飼糧中添加低劑量植物炭黑對大鼠血清ALP、GPT和GOT活性無顯著影響，但具有一定的改善趨勢，添加高劑量植物炭黑極顯著降低了第14天血清ALP活性，顯著降低了第28天血清GPT和GOT活性，并與空白對照組相比差異不顯著，這說明植物炭黑能夠緩解由ZEN引發(fā)的血清酶活性的改變，并且存在劑量效應，飼糧添加高劑量植物炭黑降低了機體對ZEN的吸收和代謝，阻抑了ZEN對肝臟的損傷，從而保護了肝臟功能。

3.3 植物炭黑對采食ZEN污染飼糧大鼠生殖系統(tǒng)的影響

ZEN具有強烈的生殖毒性，動物的生殖系統(tǒng)是其作用的主要靶器官。研究顯示，ZEN可導致動物卵巢功能和結構改變，誘導卵巢黃體空泡化，并顯著減少各階段的卵泡數(shù)量[12]。飼喂1.0 mg/kg ZEN污染飼糧可導致斷奶仔豬卵巢炎癥，血管壁增生并充血，血管中大量紅細胞和白細胞充盈，卵巢皮層原始卵泡增多[25]。研究發(fā)現(xiàn)，ZEN對卵巢的作用存在劑量效應，1.1 mg/kg ZEN能刺激卵泡發(fā)育，隨著劑量的增大(2.0、3.2 mg/kg)卵巢出現(xiàn)大量閉鎖卵泡[26]。本研究結果顯示，采食25 mg/kg ZEN污染飼糧的大鼠卵巢皮質部可見萎縮，原始卵泡、初級卵泡和初級卵母細胞明顯較對空白對照組減少，髓質部的血管少見，且第28天卵巢髓質部萎縮和血管充血更為明顯，此結果與高鑫[12]報道相一致。而在ZEN污染飼糧中添加低劑量或高劑量植物炭黑可明顯改善卵巢組織形態(tài)結構，說明植物炭黑降低了ZEN對大鼠卵巢的毒性作用，對維持卵巢的結構和功能具有較良好的作用。

ZEN與內源雌激素具有高度的相似性，可引起動物生殖激素分泌紊亂，造成雌性動物繁殖障礙。研究顯示，飼糧中含有20 mg/kg ZEN時可顯著提高大鼠血清FSH濃度，降低血清E2濃度[12]。給蛋雞灌服5、50和200 mg/kg ZEN能顯著提高血清孕酮(P4)濃度，降低血清LH濃度[19]。飼喂含有0.8和1.6 mg/kg ZEN的飼糧可顯著降低小鼠血清LH濃度，且1.6 mg/kg ZEN可顯著降低血清E2濃度，說明ZEN對生殖激素水平影響同樣存在著劑量效應[15]。本研究結果顯示，ZEN顯著或極顯著提高了大鼠第14和28天血清FSH濃度，顯著或極顯著降低了第14和28天血清E2和LH濃度。E2是一種甾體雌激素，可促進子宮內膜生長和生殖系統(tǒng)發(fā)育，F(xiàn)SH和LH具有促進卵泡發(fā)育和黃體產生的作用，試驗結果說明ZEN阻礙了生殖器官的發(fā)育和功能發(fā)揮，破壞了機體對生殖系統(tǒng)的調節(jié)能力，干擾了大鼠生殖激素的正常分泌。研究顯示，在飼糧中添加1 mg/kg ZEN可顯著降低青年母豬血清E2濃度，而添加不同種類霉菌毒素吸附劑(包括酵母細胞壁類、硅鋁酸鹽類、改性硅鋁酸鹽類和復合型吸附劑)后血清E2濃度未能顯著改善，但在一定程度上得到恢復[8]。在ZEN污染的飼糧中添加200和500 mg/kg水飛薊素緩解了由ZEN引起的大鼠血清E2和FSH濃度的降低[12]。本研究結果顯示，在ZEN污染的飼糧中添加低劑量植物炭黑可極顯著提高大鼠第14天血清LH濃度，而對第14天血清FSH、E2和PRL濃度以及第28天血清生殖激素水平無顯著影響；而添加高劑量植物炭黑可極顯著降低大鼠第14天血清FSH濃度，顯著降低第28天血清FSH濃度，極顯著提高第14天血清E2、LH濃度和第28天血清E2濃度，這說明高劑量植物炭黑改善了大鼠體內激素分泌水平。雌激素對下丘腦和垂體發(fā)揮著負反饋調節(jié)功能，當動物攝入具有類雌激素作用的ZEN后可降低垂體分泌促性腺激素水平，導致LH和FSH水平進一步降低[27]。而在飼糧中添加高劑量植物炭黑可吸附ZEN，使得大鼠雌激素、下丘腦和垂體之間保持相對的平衡，從而維持機體正常的激素水平和繁殖功能，因此推薦植物炭黑適宜添加劑量為1.5 g/kg。

4 結 論

植物炭黑能夠提高采食ZEN污染飼糧大鼠的ADG，顯著降低F/G，顯著降低血清ALP、GPT和GOT活性，調節(jié)血清FSH、LH和E2等生殖激素的正常分泌，從而改善大鼠生長性能，緩解ZEN對肝臟和卵巢的損傷，維持正常繁殖功能。推薦植物炭黑適宜添加劑量為1.5 g/kg。