25羥基維生素D3和維生素D3對荷斯坦種公牛精液品質和血清生化指標的影響

馮冠智 徐宏建 王麗華 張城瑞 祖智富 張永根*

(1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436)

目前，人工授精技術在家畜育種和遺傳改良中起著至關重要的作用[1]。精液品質反映公畜的繁殖性能并決定著人工授精成功與否，因此要提高精液品質，從而提高人工授精的成功率。荷斯坦種公牛的繁殖力是影響我國奶牛繁殖性能和牧場盈利的重要因素。鈣和磷主要分布在動物骨骼中，是動物正常生長繁育必不可缺少的元素。而維生素D3能夠增加鈣和磷的吸收率，調節動物體內的鈣和磷的穩態，提高精液品質，促進生殖器官發育；能夠增加骨骼硬度與強度，從而增加動物骨骼礦物質元素沉積，減少骨質疏松和骨軟化癥的發生，減少肢蹄疾病的產生，從而減少荷斯坦種公牛的淘汰率及減少企業的經濟損失。

種公牛在生產過程中由于氧化應激會產生活性氧自由基，活性氧自由基顯著影響睪丸功能、睪酮水平和精母細胞凋亡，自由基的積累可導致種公牛繁殖能力受到損傷。精液生成過程中活性氧自由基的增加會破壞精子的超微結構和功能，導致其形態學、運動性和染色質結構的破壞。活性氧的產生破壞了精子的線粒體膜，導致種公牛精子發生損傷。因此，提高公牛精液的抗氧化能力具有十分重要的意義。

維生素D3是維生素D的一種非活性形式，它是紫外光與7-脫氫膽固醇反應的產物[2]。維生素D3產生后首先在肝臟線粒體和微粒體中發生羥基化，生成25羥基維生素D3。血液循環中25羥基維生素D3在腎臟中經1α-羥化酶羥化生成1,25二羥維生素D3。使用25羥基維生素D3可以有效提高血液25羥基維生素D3和鈣、磷含量，減少鈣磷代謝異常從而有效保證了家畜的骨骼發育[3]。近年來，隨著對維生素D3研究的不斷深入，維生素D3的諸多功能不斷被發現，例如抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等特性。研究表明，維生素D缺乏會損害動物和人類精液品質[4]。飼喂高劑量維生素D3可提高血清25羥基維生素D3含量以及改善育種公豬精子質量，提高激素水平。血漿25羥基維生素D3含量是反映動物機體維生素D3狀況的最好指標[5]。25羥基維生素D3的吸收效率和體內代謝活性均高于維生素D3，因此直接飼喂25羥基維生素D3會更有利于機體直接吸收，從而使精液品質提高。曹令勤等[6]研究報道，25羥基維生素D3有效緩解了繁殖后期種公雞應激，提高了機體對營養物質的代謝吸收，從而提高了精子密度、精子活力及有效精子數，改善種公雞的精液品質。董洪俊[4]研究報道，種公豬飼糧中添加25羥基維生素D3能更有效增加血漿維生素D含量，從而改善精子的形態和運動能力，提高公豬的繁殖性能。

維生素D3水平與種公牛的繁殖能力有關。然而，有關25羥基維生素D3對荷斯坦種公牛的精液品質和健康影響的研究卻鮮有報道。因此，本研究的目的是探究：1)25羥基維生素D3替代維生素D3是否能夠改善種公牛的精液品質；2)25羥基維生素D3替代維生素D3對種公牛鈣磷代謝調節、激素分泌和抗氧化能力是否有促進作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧

所有動物試驗操作均按照東北農業大學動物保護委員會的原則和操作指南進行(編號：NEAU-[2011]-9)。本試驗在上海奶牛育種中心進行。試驗選取16頭荷斯坦種公牛(24～36月齡)，根據體重和精子活力隨機分為2個處理：1)飼糧添加維生素D3(300 IU/kg)，2)飼糧添加25羥基維生素D3(300 IU/kg)。試驗期為60 d。公牛被拴系在單獨的圍欄里，圍欄上配有自動飲水器。在相同的光照條件下。每天于07：00和13：30飼喂2次。自由采食。每天調整給料量，以達到至少5%的剩料量。每周二于08:30進行采精1次。

基礎飼糧組成及營養水平如表1所示，精料由光明牧業有限公司配制。25羥基維生素D3由山東某生物工程有限公司提供(產品含量20 000 IU/g)。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 精液采集與質量評價

于試驗期第60天08：30用預熱過的人工陰道采集精液。采集后，分別用量杯法和血球計法測量精液體積和密度[7]。將精液滴在預熱過的顯微鏡載玻片上，用光學顯微鏡蓋上覆蓋物，以評估精子的運動能力[8]。用伊紅-黑素染色法觀察精子的活力和異常情況[9]。玻片用精液、伊紅和黑精混合染色法涂片。對載玻片中的200個精子進行計數，分為活精子(未染色)和死精子(完全或部分染色)。載玻片進一步檢查精子異常：頭部異常、尾部異常、中段異常、頭部脫落、尾部盤繞。按照Chinoy等[10]硝酸銀染色法評價精子頂體完整性。按照Revell等[11]采用低滲透腫脹試驗評估精子質膜完整性。

采集精液，轉入精漿分離管中。于1 500×g離心15 min，分離精漿，收集上清，再于14 000 r/min，離心10 min，分離剩余精子。精漿在-20 ℃冷凍保存，待分析。精漿超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性，總抗氧化能力及丙二醛、還原型谷胱甘肽含量使用商業試劑盒(南京建成生物工程研究所)，按說明書方法測定。按照Martinez等[12]采用原子吸收方法測定精漿鈣和鎂含量。精漿磷含量采用鉬藍法[13]測定。

1.3 血液采集與分析

于試驗第60天晨飼后3 h經尾靜脈采血，使用不含抗凝血劑的真空管進行血清分離(3 000×g離心15 min)。原子吸收法測定血清鈣和鎂含量。采用鉬藍法測定血清磷含量。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中25羥基維生素D3、1,25二羥基維生素D3含量(華英生物技術研究所測定)。采用放射免疫試劑盒對血清17β-雌二醇、睪酮、皮質醇和生長激素含量進行分析(華英生物技術研究所測定)。采用比色法分析試劑盒(南京建成生物工程研究所)分析血清超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，總抗氧化能力及丙二醛、還原型谷胱甘肽含量。

1.4 數據處理與分析

本試驗數據處理采用SAS 9.4統計軟件的PROC GLM模塊對精液品質、激素分泌、礦物質代謝進行數據分析。結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液品質的影響

由表2可知，與添加維生素D3相比，添加25羥基維生素D3存在增加種公牛精子密度的趨勢(0.050.05)。

表2 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液品質的影響

2.2 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

由表3可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高種公牛精漿的還原型谷胱甘肽含量(P<0.05)，顯著降低丙二醛含量(P<0.05)，且超氧化物歧化酶活性有提高趨勢(P=0.07)。與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高精漿中鈣含量(P<0.05)，但添加25羥基維生素D3對精漿中磷和鎂含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

2.3 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝物含量的影響

由表4可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著增加種公牛血清鈣含量(P<0.05)，極顯著提高血清磷含量(P<0.01)；飼糧添加25羥基維生素D3極顯著提高種公牛血清25羥基維生素D3和1,25二羥維生素D3含量(P<0.01)。

表4 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝物的影響

2.4 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清激素含量的影響

由表5可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高血清睪酮、17β-雌二醇含量(P<0.05)；顯著降低血清皮質醇含量(P<0.05)。

表5 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清激素含量影響

2.5 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

由表6可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著降低血清丙二醛含量(P<0.05)，顯著提高血清還原型谷胱甘肽含量和過氧化氫酶活性(P<0.05)。

表6 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液品質的影響

精液體積和精子密度數值的增加可能是由于血清雌二醇和睪酮含量的增加促進了生殖細胞、副性腺和睪丸組織的發育。Arab等[14]研究表明，維生素D可通過生殖器官和精母細胞上的維生素D受體發揮其生理作用。成熟精子頸部存在維生素D受體和代謝酶，這表明維生素D可能與精子發生與成熟存在相關性。飼糧添加25羥基維生素D3增強精子動力和頂體酶活性，可能是精液中25羥基維生素D3含量增加提高了精子頸部和頭部的鈣含量，從而增加精子能動性，這與Bedu-Addo等[15]研究結果基本一致。李亮亮等[16]研究結果表明了，精子存活率的增加可能是睪酮能夠維持生精并延長附睪中精子的壽命。此外，精子膜的完整性對脂質過氧化反應高度敏感，而活性氧是精液產生過程中有害的物質，它可以破壞精子的質膜，進而破壞細胞膜和核酸，因此精子膜完整率的增加歸因于精漿抗氧化能力的增強。Merino等[17]和Lin等[18]研究認為，25羥基維生素D3缺乏對精液質量、睪丸發育和精子產生負面影響。精液中25羥基維生素D3含量增加有可能改善種公豬的精子質量和膜完整性，這與本試驗結果一致。

3.2 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

精漿是由各種附屬腺體聯合分泌的液體組成的。精漿中抗氧化酶和礦物質可以防止氧化損傷并且與精子的存活率和精子獲能有關[19]。本試驗結果表明，在種公牛飼糧中添加25羥基維生素D3有助于提高精漿的抗氧化能力，這可能是精液中1,25二羥基維生素D3的疏水部分保護膜免受氧化的原因。種公牛精漿抗氧化酶活性的提高以及丙二醛含量的降低，這與Mukhopadhyay等[20]研究結果相似，25羥基維生素D3作為細胞抗氧化劑防止鼠淋巴瘤發生時發現，25羥基維生素D3可提高谷胱甘肽氧化酶和還原酶類活性。精子的抗氧化能力是有限的，種公牛必須借助有效的內部抗氧化劑來防止自身的氧化損傷。因此，精漿中抗氧化酶是至關重要的，因為它們能將氧化自由基控制在生理范圍內并保護精子。飼糧中添加25羥基維生素D3對種公牛精液品質的改善可能是由于抗氧化能力的增強保護精子免受氧化損傷所致。

飼糧添加25羥基維生素D3增加了種公牛精漿中鈣含量，這可能是因為睪丸生殖細胞和間質細胞對鈣的吸收并轉移至精液中。在正常范圍內增加鈣和磷含量有利于維持機體正常生理功能。然而，由鈣介導的維生素D3功能與繁殖性能之間的相關性的重要性往往被忽視。事實上，維持精液中的鈣含量比血清鈣含量對精子活力更重要。當精漿中的鈣含量比血清高2～3倍時，維生素D受體可以激活男性生殖道中活性鈣離子運輸從而增強精子活力[21]。

3.3 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝產物含量的影響

成年奶牛血液中正常鈣含量為2.2～2.5 mmol/L，而磷在血液中正常含量為1.3～2.6 mmol/L，本試驗血清中鈣和磷含量均處于正常范圍內，飼糧添加25羥基維生素D3的種公牛血清鈣和磷含量顯著高于添加維生素D3。維生素D可促進骨中鈣、磷釋放入血，促進腎小管對鈣磷的重吸收作用，在小腸黏膜細胞中與特異的受體蛋白相結合從而增加了運鈣蛋白的合成，提高血清鈣、磷含量。與Martinez等[22]研究結果相同，飼糧添加25羥基維生素D3提高血清25羥基維生素D3、鈣和磷含量。正常奶牛血液中25羥基維生素D3含量為40～100 ng/mL。在本試驗中，飼糧添加維生素D3種公牛血清25羥基維生素D3含量在正常范圍內，而飼糧添加25羥基維生素D3種公牛血清25羥基維生素D3含量是飼糧添加維生素D3種公牛的2倍，這與Celi等[23]研究表明一致，飼喂生長犢牛25羥基維生素D3顯著提高了血清和組織中25羥基維生素D3和1,25二羥基維生素D3含量。總磷含量的增加抑制了1α-羥化酶活性，盡管抑制了1α-羥化酶合成1,25二羥基維生素D3，但添加25羥基維生素D3仍能顯著提高公牛血清1,25二羥基維生素D3的含量[24]。25羥基維生素D3羥基化為1,25二羥基維生素D3也發生在腎臟以外的細胞組織中，如上皮細胞、睪丸間質細胞以及免疫細胞[25]。血清中25羥基維生素D3含量的增加改善了精液質量和性激素分泌，這可能是由于25羥基維生素D3為間質細胞中1,25二羥基維生素D3的合成提供了充足的底物。

3.4 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清激素含量的影響

睪酮調節生殖細胞分化是睪丸正常發育和精子發生的先決條件。與添加維生素D3相比，攝入25羥基維生素D3的種公牛血清睪酮含量更高，這與Lin等[18]研究報道一致，維生素D對精液品質的調控作用可能與其提高血漿睪酮含量有關。Hofer等[26]研究表明，睪酮合成酶對睪丸間質細胞的睪酮合成起著關鍵作用，它主要是由17β-羥類固醇脫氫酶、3β-羥基類固醇脫氫酶以及CYP11A1和CYP17A1基因調控的雄激素組成的，1,25二羥基維生素D3刺激了人腎上腺皮質細胞的CYP11A1和CYP17A1的合成，從而促進了睪酮合成酶產生，提高了血清睪酮的含量。雌二醇在精子發生過程中起著重要作用，包括精細胞的增殖、分化和最終的成熟，以及存活和凋亡。被1,25二羥基維生素D3激活的維生素D受體對嚙齒動物生殖器官的雌激素合成具有直接的調節作用，這與Keiko等[27]研究結果一致。Weerakoon等[28]研究報道，肉牛血液中較低的雌二醇含量抑制了精液繁殖能力。而且精子活力可能與血清雌二醇含量呈正相關[29]。此外，更多的雌二醇能夠促進青年肉牛睪丸的發育[30]。

本研究結果表明，飼喂25羥基維生素D3可以降低成年公牛的血清皮質醇含量，這與王可寶[31]研究報道一致。Weerakoon等[28]研究報道，較高的血清皮質醇含量會導致青年公牛精液異常。公牛體內皮質醇含量的增加抑制了睪酮的分泌[32]。血清皮質醇含量的變化可能會因動物的應激和動物的性情而有所不同[33]。但在試驗期間，只允許2名訓練有素的工作人員管理動物和取樣，盡量減少種公牛的應激。

3.5 不同形式維生素D3對荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

維生素D3缺乏對氧化應激和抗氧化標志物存在負面影響。維生素D3有可能改善家畜的抗氧化功能[34]。Yang等[35]研究發現，飼糧中添加25羥基維生素D3可提高斷奶仔豬血清谷胱甘肽含量、過氧化氫酶活性并且降低丙二醛含量，這與本試驗結果相同。此外，血清1,25二羥基維生素D3可能是潛在的膜抗氧化劑，因為它通過其疏水部分保護膜免受脂質過氧化[36]。

4 結 論

與添加同等水平維生素D3相比，種公牛飼糧中添加25羥基維生素D3能更有效地增加精漿鈣含量以及抗氧化能力，從而提高精子的活力和存活率，改善種公牛的精液質量，并能夠提高血清中鈣、磷和25羥基維生素D3以及睪酮和雌二醇含量，改善種公牛的抗氧化狀態。