瘤胃和牛奶中奇鏈支鏈脂肪酸含量與瘤胃微生物蛋白產量的相關性研究

劉 鑫 姜 鑫 徐宏建 張淑枝 管佳琦 辛杭書*

(1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.扶余禾豐飼料有限公司，扶余 131200；3.沈陽禾豐反芻動物飼料有限公司，沈陽 110164；4.沈陽農業大學動物科學與醫學學院，沈陽 110161)

現階段測定瘤胃微生物蛋白(MCP)方法很多，但多數會對動物造成不同程度的傷害，且成本較高，因此，不管是從學術角度出發，還是從應用實踐方面考慮，都有必要研究出一種簡單易行并對試驗動物無損害的方法來估測反芻動物瘤胃中MCP含量。1962年，美國馬里蘭大學的學者Keeney等[1]首次提出，奇鏈支鏈脂肪酸(odd- and branched-chain fatty acids，OBCFA)主要來自于瘤胃微生物的合成，而非動物自身合成。OBCFA包括奇數直鏈脂肪酸(OCFA)和支鏈脂肪酸(BCFA)，支鏈脂肪酸主要是具有甲基支鏈的飽和脂肪酸，根據甲基位置不同，分為異構(iso)脂肪酸和反異構(anteiso)脂肪酸[2]。OBCFA主要包括：十四烷酸的異構體(iso-tetradecanoicaicd，iso-C14∶0)、十五烷酸(pentadecanoic acid，C15∶0)、13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid，iso-C15∶0)、12-甲基十四烷酸(12-methyltetradecanoic acid，anteiso-C15∶0)、棕櫚酸的異構體(iso-hexadecanoic acid，iso-C16∶0)、十七烷酸(heptadecanoic acid，C17∶0)、15-甲基棕櫚酸(15-methylhexadecanoic acid，iso-C17∶0)、14-甲基棕櫚酸(14-methylhexadecanoic acid，anteiso-C17∶0)。這些脂肪酸滿足瘤胃微生物內部標記的大多數要求，因為它們是穩定的化合物，通過非侵入性的手段在牛奶中容易獲得，不影響動物福利，且易于測定。OBCFA可隨微生物物種變化而改變[3]，且在液相(LAB)和固相(SAB)細菌之間也存在差異[4]。與嘌呤/氮(PB/N)不同，LAB和SAB之間的OBCFA/蛋白質沒有差異，這是將OBCFA作為瘤胃微生物內部標記的一個優勢[5]。因此，OBCFA很可能具備作為瘤胃微生物標記物的潛能。

2000年，英國學者Dewhurst等[6]提出，可以通過動物產品中的OBCFA含量，對從瘤胃流出的微生物進行定量估測。隨后Vlaeminck等[7]將10種常見的奶牛飼糧分為4種類型，分別以其為底物經過體外發酵21 h后發現，隨著飼糧中淀粉含量的增加，發酵液中奇直鏈脂肪酸(C15∶0和C17∶0)在總OBCFA的比例也隨之增加，而中性洗滌纖維(NDF)的含量與發酵液中的anteiso-C15∶0含量呈顯著的正相關關系，并且OBCFA含量與發酵液中的乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比例也高度相關，其R2值分別達到79.6%、86.6%和84.9%；而后，研究者又進一步提出，基于多元線性回歸發現瘤胃內的pH及氨態氮(NH3-N)含量和揮發酸(VFA)的摩爾比例與OBCFA含量密切相關，通過OBCFA含量能夠反映瘤胃環境狀況[8]，且與飼糧組分比較，瘤胃中的OBCFA含量更能準確預測出瘤胃的發酵模式[9-10]。Vlaemick等[7]建立了在牛奶和十二指腸中排泄的嘌呤堿(PB)和二氨基丙酸(DAPA)數量與OBCFA含量之間的關系，這些關系通過Cabrita等[11-12]描述的獨立試驗數據進行驗證，發現基于乳OBCFA含量的預測比基于飼糧的模型能更好地描述十二指腸MCP流量的變化[13]。而Castro-Montoya等[14]在荷斯坦奶牛的試驗中，得出鳥嘌呤衍生物含量與牛奶OBCFA含量并不存在相關關系的結論。引起不同試驗結果的原因尚不明確，所以，有學者提出，對于OBCFA從瘤胃轉運到牛奶的途徑，仍需要大量的研究工作[15]。

根據Song等[16]的研究發現，瘤胃灌注不同濃度的氨素能夠顯著影響瘤胃發酵模式以及MCP產量，也改變了進入十二指腸的微生物流入量，而OBCFA主要來自于瘤胃微生物[1]，因此，氨素的攝入量也可以改變瘤胃及牛奶中OBCFA的產量。體外試驗結果表明，OBCFA含量與瘤胃微生物存在相關關系[17]，為進一步驗證OBCFA含量與瘤胃MCP含量的相關性，需要進行體內試驗。因此，本試驗對奶牛瘤胃灌注不同劑量碳酸氫銨(NH4HCO3)，旨在更加充分地評價OBCFA含量和瘤胃MCP含量的相關性，以期為OBCFA作為奶牛MCP標記物提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和樣品采集

奶牛分別在每天07:00和14:00飼喂等量的全混合日糧，其組成及營養水平見表1，自由飲水。于每日07:00、14:00和21:00進行3次擠奶，每頭牛每次取3個重復。根據早、中、晚3次的產奶量，將牛奶按照比例進行混合，共27個樣本，于-20 ℃保存，用于測定牛奶中OBCFA含量。

于采樣期晨飼后2、4、6、8、10和12 h進行瘤胃液和瘤胃內容物采集，共54個樣本。將瘤胃液經4層紗布過濾后，取10 mL進行pH測定，然后平均分裝在2個10 mL離心管中，分別向每個離心管中加入1 mL 25%的偏磷酸，于-20 ℃保存，用于測定VFA和NH3-N含量。然后，將200 mL瘤胃內容物進行凍干處理，用于MCP和OBCFA含量的測定。

1.2 瘤胃和牛奶中OBCFA含量的測定

1)試劑和配制方法。10%鹽酸甲醇：將10 mL乙酰氯逐滴加入到100 mL甲醇中。6% K2CO3溶液：6 g K2CO3溶解于100 mL純水中。氣相色譜內標溶液：0.2 g十九烷酸溶于100 mL苯中，冷藏保存。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

2)分析方法。脂肪酸的提取和甲基化基于Sukhija等[18]描述的方法并加以改進。準確稱量凍干樣品200 mg置于15 mL離心管中。加入1 mL含有內標的苯，1 mL苯和3 mL 5%鹽酸甲醇。緩慢旋渦1 min，使樣品離管底2～3 cm。70 ℃水浴2 h后，冷卻至室溫，并加入5 mL 6% K2CO3和2 mL苯。中速漩渦30 s后于1 500 r/min離心5 min，并將上部有機相轉移至5 mL EP管中。向培養管中的苯提取物中加入1 g無水硫酸鈉，再次渦旋30 s并靜置1 h。培養管于1 500 r/min離心5 min，并將含有甲酯的上層轉移到新的培養管中，用N2吹至近干，重新溶于1 mL苯中，所得溶液利用氣相色譜儀(島津GC-2010)測定OBCFA含量。

3)氣相色譜測定條件。使用EquityTM-1氣相色譜柱(15 m×0.1 mm×0.1 μm)；分析條件為：分流比為200∶1，進樣口和檢測器保持在280 ℃。升溫程序從175 ℃開始，以15 ℃/min增加至275 ℃，保持1 min來分離脂肪酸甲酯。氣流：載氣氮氣，45 cm/s；氫氣，40 mL/min；空氣，400 mL/min。通過將它們的保留時間與外標的保留時間進行比較來鑒定脂肪酸甲酯。

1.3 瘤胃發酵參數的測定

1.3.1 pH的測定

取出瘤胃液后，立即用Statious-10 pH計測定pH。

1.3.2 NH3-N含量的測定

采用靛酚藍法測定瘤胃液中NH3-N的含量[19]，測定儀器為紫外分光光度計(UV1901；波長：550 nm)。

1.3.3 VFA含量的測定

參照Stewart等[20]描述的方法，采用氣相色譜儀(島津GC-2010)測定瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的含量。

1.3.4 MCP含量的測定

瘤胃液中MCP含量根據Zinn等[21]報道的分光光度法進行測定，測定儀器為紫外分光光度計(UV1901；波長：260 nm)。

1.4 數據處理與分析

所有數據均采用SAS 9.2進行統計分析。使用MIXED模型對瘤胃發酵指標及MCP、OBCFA含量進行差異統計分析。P<0.05代表差異顯著，結果用平均值和標準誤的形式表示。使用PROC CORR過程分析OBCFA含量與pH及NH3-N、MCP和VFA含量之間的關系，分析結果通過Pearson方法進行檢驗，P<0.10表示趨于相關，P<0.05表示顯著相關。OBCFA含量作為自變量數據集，MCP含量和發酵參數數據作為變量數據集。多元回歸分析利用REG過程的STEPWISE方法，得到的方程使用最小二乘法估計顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 瘤胃灌注不同劑量的NH4HCO3對瘤胃和牛奶中OBCFA含量的影響

由表2可知，瘤胃灌注NH4HCO3顯著改變瘤胃內異構十四烷酸(iso-C14∶0)、異構十七烷酸(iso-C17∶0)和總異構脂肪酸(total iso-fatty acids，TIFA)的含量(P<0.05)，其中，iso-C14∶0和TIFA的含量隨著NH4HCO3灌注劑量的升高呈現先降低后增加的變化，而iso-C17∶0的含量逐漸增加。其他脂肪酸含量并沒有顯著變化(P>0.05)。

由表3可知，牛奶中只有反異構十五烷酸(anteiso-C15∶0)的含量隨著NH4HCO3灌注劑量的升高有逐漸升高的趨勢(P=0.07)，而其他脂肪酸含量并無顯著變化(P>0.05)。

表2 瘤胃灌注不同劑量的NH4HCO3對瘤胃OBCFA含量的影響

以上指標，表3同。Above indexes, the same as Table 3.

表3 瘤胃灌注不同劑量的NH4HCO3對牛奶中OBCFA含量的影響

2.2 瘤胃灌注不同劑量的NH4HCO3對瘤胃發酵參數和MCP含量的影響

由表4可知，隨著瘤胃灌注NH4HCO3劑量的增加，MCP的含量有逐漸增加的趨勢(P=0.06)。而其他發酵參數均未見顯著變化(P>0.05)。

表4 瘤胃灌注不同劑量的NH4HCO3對瘤胃發酵參數和MCP含量的影響

2.3 瘤胃和牛奶中OBCFA含量與瘤胃發酵參數及瘤胃MCP含量的相關關系

由表5可知，瘤胃中OBCFA含量與瘤胃發酵參數及MCP含量存在顯著的相關關系(r=0.26～0.84；P<0.05)。且較強相關關系存在于乙酸與C15∶0(r=0.60)、iso-C17∶0(r=0.52)及TOFA含量(r=-0.52)；丙酸與C15∶0(r=0.51)、iso-C16∶0(r=-0.60)、iso-C17∶0(r=-0.52)、TIFA(r=-0.64)和OBCFA含量(r=-0.52)；丁酸與C15∶0(r=-0.53)和C17∶0含量(r=-0.58)；異戊酸與anteiso-C17∶0含量(r=0.53)；乙酸/丙酸與C15∶0(r=0.57)、iso-C16∶0(r=-0.52)、iso-C17∶0(r=0.54)、TIFA(r=0.64)、TOFA(r=0.55)及OBCFA含量(r=0.52)；MCP與anteiso-C15∶0(r=0.79)、anteiso-C17∶0(r=0.76)和TAFA含量(r=0.84)。

由表6可知，牛奶中OBCFA含量與瘤胃發酵參數及MCP含量存在顯著的相關關系(r=0.11～0.89；P<0.05)。且較強相關關系存在于pH與anteiso-C17∶0(r=-0.76)和TAFA含量(r=-0.73)；NH3-N與iso-C17∶0(r=0.71)、C17∶0(r=0.84)和TBFA(r=0.84)和TOBCFA含量(r=0.84)；乙酸與anteiso-C15∶0(r=-0.89)、TAFA(r=-0.81)和TBFA含量(r=-0.76)；丁酸與anteiso-C15∶0(r=0.76)、anteiso-C17∶0(r=0.71)、TAFA(r=-0.76)、TBFA(r=0.81)和TOBCFA含量(r=0.71)；戊酸與anteiso-C15∶0(r=0.72)和TAFA含量(r=-0.75)；乙酸/丙酸與anteiso-C15∶0含量(r=-0.76)；MCP與anteiso-C15∶0含量(r=0.78)。

利用瘤胃和牛奶中OBCFA含量建立瘤胃發酵參數和MCP含量的預測方程如表7所示。預測方程經最小二乘法估計發現均在顯著水平(P<0.05)，除異丁酸和戊酸含量外，其他各種VFA含量預測方程的R2值相近。利用瘤胃中OBCFA含量預測乙酸、丙酸和丁酸含量的R2分別為0.56、0.47和0.42，而利用牛奶中OBCFA含量預測乙酸和丁酸含量的R2分別為0.79和0.58。利用瘤胃和牛奶中OBCFA含量預測MCP含量，回歸方程的R2分別為0.96和0.60。

3 討 論

本試驗中隨著NH4HCO3劑量的增加，瘤胃中iso-C17∶0的含量有逐漸增加的趨勢，但牛奶中的含量并沒有顯著變化，這與脂肪酸在乳腺中的重新合成有關。而Cabrita等[11]研究顯示，隨尿素替代比例增為1%，飼糧中真蛋白的含量降低，牛奶中iso-C17∶0的含量減少，與本試驗結果存在差異的原因可能是飼糧結構導致的。OBCFA主要存在于微生物的細胞膜上[2]，因此，OBCFA含量的變化可以在一定程度上反映出瘤胃微生物的變化。本研究發現，向瘤胃中灌注高劑量的NH4HCO3時，顯著改變了牛奶中TIFA的含量，尤其是iso-C14∶0和iso-C17∶0的含量，這說明氮素供給的增加，可能與瘤胃中攜帶異構脂肪酸的微生物的增長有某種關聯，但具體機制尚不清楚，需要進一步的深入研究。

表5 瘤胃中OBCFA含量與發酵參數和MCP含量的相關關系

表6 牛奶中OBCFA含量與發酵參數和MCP含量的相關關系

表7 利用瘤胃和牛奶中OBCFA含量建立瘤胃發酵參數和MCP含量的預測方程

研究發現，瘤胃微生物對NH3-N含量耐受范圍為6～30 mg/mL[1]，若NH3-N含量過低，瘤胃發酵的“解偶聯”會導致MCP合成效率下降[22]。本試驗中，隨NH4HCO3灌注劑量的增加，奶牛瘤胃NH3-N含量升高并均處于正常范圍內，說明NH4HCO3的灌注能夠在不影響瘤胃功能的前提下，為瘤胃微生物提供更多的氮源。此外，盡管本研究中各個VFA的含量未因NH4HCO3的灌注劑量不同而發生明顯變化，但隨NH4HCO3灌注劑量升高，TVFA含量呈上升趨勢。這可能是由于NH4HCO3的灌注促進了瘤胃微生物的活動，進而促進碳水化合物降解，最終導致更高的VFA含量。更高的VFA含量能夠為微生物活動提供更多的能量[23]。因此，NH4HCO3的灌注為瘤胃微生物合成MCP提供了充足的能量和氮源，這也是本試驗中瘤胃MCP含量隨NH4HCO3灌注劑量增加而增加的原因。

本研究中，瘤胃內的異構脂肪酸含量與pH之間存在正相關，這是可以預料的，因為纖維分解菌中富含異構脂肪酸[24]，pH偏低時會對纖維分解菌產生負面影響[25]，因此pH降低會減少瘤胃內的異構脂肪酸含量。Zhang等[26]研究發現，OBCFA和乙酸含量之間存在正相關，但與丙酸和丁酸含量之間存在負相關，可能與游離形式存在的VFA在瘤胃壁的吸收率不同(丙酸>乙酸)所致[27]，本研究也發現了類似的現象。同樣，Vlaeminck等[8]建立的預測方程經過有效性檢驗，認為牛奶乳脂中的OBCFA含量可以估測瘤胃中VFA的含量。

MCP是奶牛代謝蛋白供應的主要成分，而OBCFA是瘤胃微生物細胞膜的獨有成分[28]。本試驗數據表明，MCP含量與anteiso-C15∶0和anteiso-C17∶0的含量均存在較強的正相關關系，可能與瘤胃內發酵糖和肽類物質的細菌(如普雷沃氏菌、多毛毛螺菌和溶糊精琥珀酸弧菌)多含反異構脂肪酸有關，例如，普雷沃氏菌中的anteiso-C15∶0含量可達到3.67 g/kg脂肪酸[24]。此外，線性回歸分析顯示利用anteiso-C15∶0和anteiso-C17∶0含量來預測MCP含量的R2較高，這一結果表明，用此2種脂肪酸可預測瘤胃MCP含量。同時，也有研究表明，OBCFA含量預測MCP含量的變化具有穩健性，且固相和液相相關細菌中的OBCFA∶N比例相對恒定[4]，這也意味著瘤胃中OBCFA作為預測微生物產量的標記物具有很大的潛力。

然而，關于是否可以利用牛奶中OBCFA的含量來預測MCP含量，學術界存在不同看法。Vlaeminck等[13]認為，用牛奶中的OBCFA含量之所以可作為MCP的潛在生物標志物，是由于牛奶中OBCFA和十二指腸微生物中的二氨基庚二酸以及嘌呤堿基含量之間存在正相關關系。然而，Dewhurst等[22]發現奶中OBCFA和十二指腸微生物中的嘌呤堿基含量之間沒有任何關系。隨后Castro-Montoya等[29]為探索OBCFA作為瘤胃MCP潛在生物標志物的可行性，研究了尿液中嘌呤和氮濃度與牛奶中OBCFA比例和含量之間的相關關系，結果顯示，牛奶中OBCFA的比例和含量與通常用作瘤胃MCP含量指標的尿液參數之間沒有密切關系。難以確定牛奶中OBCFA含量與瘤胃MCP含量之間的定量關系可能是由于[30-31]：1)各種OBCFA腸道吸收效率的差異；2)OBCFA運輸到血液中的“模式”不同；3)某些OBCFA會在乳腺或其他組織中重新合成；4)脂肪組織中會儲存一些OBCFA，并且其會在脂肪動員期間得到釋放；5)從瘤胃流向十二指腸時，OBCFA轉移到牛奶中的比例降低。Westreicher-Kristen等[32]提出通過牛奶中單個或全部OBCFA含量只能適度地預測MCP的合成，很可能是OBCFA在流入牛奶的過程中發生了轉移或者微生物群落組成發生變化所致。本研究利用OBCFA在多元線性回歸的基礎上預測MCP含量，從當前結果來看，并非所有的OBCFA都是MCP含量的可靠或準確的預測指標，可能是單個脂肪酸的反應比一組脂肪酸更為敏感，在一個組內會發生某些拮抗作用，這意味著一個特定脂肪酸含量的增加可能與其他具有相似結構的脂肪酸含量的減少有關，從而抵消了某些OBCFA的預測能力。根據本試驗結果所展現的anteiso-C15∶0與MCP含量之間的相關關系，我們可以認為，作為非侵入性預測MCP含量的方法，利用牛奶中OBCFA含量仍是一種有潛力的途徑，但要提高預測的準確性，未來仍然需要大量的深入研究，以闡明瘤胃中OBCFA含量與牛奶中OBCFA含量的準確關系。

4 結 論

瘤胃灌注高劑量NH4HCO3能夠顯著增加瘤胃內iso-C14∶0和iso-C17∶0和總異構脂肪酸的含量，同時瘤胃MCP的含量也隨之趨于提高。此外，瘤胃中的anteiso-C15∶0和anteiso-C17∶0以及牛奶中的anteiso-C15∶0與MCP含量呈顯著正相關，因而它們具有作為標記物預測瘤胃MCP含量的潛力。