微生態制劑對種母雞生產性能、降血脂和抗氧化作用的研究

魏 帥 劉 慧 陳猜猜 張紅星 謝遠紅 金君華 熊利霞

(北京農學院食品科學與工程學院，微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 102206)

2020年農業農村部指出在飼糧中禁用除中草藥外其他促生長類藥物添加劑，開發綠色、安全、無公害的抗生素替代產品是畜禽養殖發展的必然趨勢[1]，微生態制劑因其天然的安全性具有明顯優勢[2-3]。京紅1號種母雞品種是我國自主創新的新品種，具有生產性能優越、繁殖力高和適應性強的特性，但是養殖過程種母雞會受到應激刺激、抵抗力下降、腸道功能紊亂、藥物殘留等影響，導致養殖成本不斷攀升、疫病防控形式嚴峻和食品質量安全得不到保障，如何能夠提高種禽生產性能和養殖效益已成為當下研究的熱點。脂肪肝綜合征(fatty liver syndrome,FLS)又稱脂肝病，多數母雞產蛋后或產蛋率達不到高峰時才被發現患有FLS，主要是由于雞體內脂肪代謝出現紊亂，大量脂類物質沉積在肝臟，導致肝臟出現脂肪變性的一種營養代謝性疾病[4]。邢冠潤等[5]發現在飼糧中添加1×107CFU/g凝結芽孢桿菌微生態制劑可顯著提高產蛋后期蛋雞生產性能和免疫能力，改善蛋品質和蛋雞腸道健康；于雷等[6]發現芽孢桿菌微生態制劑能夠顯著提高京紅1號蛋雞產蛋率和平均蛋重，降低料蛋比。孫玲[7]研究在種母雞飼糧中添加微生態制劑發現能顯著降低血清甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，顯著增加血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)，表明微生態制劑能有效提高種母雞的脂質抗氧化能力。芽孢桿菌作為新型飼料添加劑，具有安全、高效、耐高溫、耐酸堿和抗逆性強等特點[8]。劉聰等[9]發現京紅1號種母雞感染沙門氏菌后，在基礎飼糧中添加2.5×1010CFU/kg的凝結芽孢桿菌可以明顯增強機體抗氧化能力，降低脂質過氧化物MDA含量，緩解氧化應激；王騰等[10]在雪峰烏骨雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌，血清中的T-AOC和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性顯著提高。目前有關副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1對京紅1號種母雞提高生產性能、FLS的預防及其抗脂質過氧化能力的研究尚未見國內外報道。因此，本文以京紅1號父母代種母雞為試驗對象，旨在研究基礎飼糧中添加副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1和副干酪乳桿菌KL1∶枯草芽孢桿菌Liu-c1=1∶1復合微生態制劑對種母雞生產性能和抗脂質過氧化能力的影響，并觀察油紅O染色的肝臟組織切片和測定肝臟粗脂肪含量，為微生態制劑在種母雞生產應用提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

副干酪乳桿菌KL1(CGMCC No.11533)為本課題組高產膽鹽水解酶和胞外多糖的專利菌株；枯草芽孢桿菌Liu-c1(CGMCC No.20840)為本課題組高產中性蛋白酶和淀粉酶的專利菌株，上述菌株均在本課題組實驗室凍藏保存。

1.1.2 微生態制劑

將副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1的甘油保藏管分別經活化、擴大培養、高密度發酵、離心濃縮和真空冷凍干燥后得到活菌數為8×1010CFU/g的副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1微生態制劑，將2種微生態制劑分別用麥芽糊精稀釋，得到活菌數為8×108CFU/g的微生態制劑預混料，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 試驗設計與基礎飼糧

試驗預試期1周后，選取同一飼養條件下健康且體重接近的54周齡京紅1號父母代種母雞384只，隨機分成空白組、KL1組、Liu-c1組和復合組，每組96只(每組6個重復，每重復16只)進行為期8周的正式試驗，空白組飼喂基礎飼糧，試驗組(KL1組、Liu-c1組和復合組)分別在飼喂基礎飼糧中添加1 g/kg的副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1和副干酪乳桿菌KL1∶枯草芽孢桿菌Liu-c1=1∶1的試驗飼糧，使各試驗組每日攝入活菌數量為8×107CFU/只。基礎飼糧由北京市某禽業有限公司提供，其組成及營養水平如表1所示。

飼養條件依據該禽業有限公司飼養管理規定操作：3層A字型階梯式籠養(47 cm×47 cm)，每籠4羽，光照強度10～15 lx，時長恒定15.5 h，溫度18～25 ℃，相對濕度40%～70%。每日投料3次，雞只自由采食、飲水，雞舍內采用濕簾降溫，風機通風，定期清理糞便，環境、用具皆消毒。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items含量 Content營養水平 Nutrient levels2)粗蛋白質 CP16.50代謝能 ME/(MJ/kg)11.10鈣 Ca3.50有效磷 AP0.36賴氨酸 Lys0.82蛋氨酸 Met0.40

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集

產蛋性能：每天統計并記錄各組產蛋總重量、產蛋總數、合格種蛋數量(非破、軟、砂殼蛋、畸形蛋、鋼皮蛋，并且蛋重在53～72 g)和日耗料量，計算第8周平均蛋重、平均日采食量、產蛋率、種蛋合格率和料蛋比。

血液采集：第8周末，從每個重復中選取1只種母雞進行血液采集(采樣前需空腹12 h)，用無菌注射器從翅下靜脈采血5 mL左右，于室溫下凝血2 h得到血液樣品。

肝臟組織：第8周末，從每個重復中血液采集后的種母雞進行解剖，迅速剪取約1.5 cm3的肝臟組織塊，經生理鹽水清洗后，立即浸于中性福爾馬林固定液中固定備用。

1.3.2 測定方法及指標

1.3.2.1 生產性能的測定

平均蛋重(g)=統計期內產蛋總重/
統計期內產蛋個數；平均日采食量(g)=統計期內消耗飼糧總重/
統計期內總雞只數；產蛋率(%)=(統計期內產蛋總數/
統計天數總雞只數)×100；種蛋合格率(%)=(統計期內合格種蛋數量/
統計期內產蛋總數)×100；料蛋比=統計期消耗飼糧總量/
統計期內產蛋總重。

1.3.2.2 肝臟組織顯微鏡觀察

肝臟油紅O脂肪染色后，于CX21型生物顯微鏡(biological microscope)(日本奧林巴斯)下觀察肝臟脂肪滴變化。

1.3.2.3 肝臟組織粗脂肪含量測定

剩余肝臟組織用錫箔紙包好，于液氮罐中速凍，-45 ℃保存備用，使用SoxtecTM-8000型索氏浸提系統(Soxhlet extraction system)(丹麥FOSS)依據《食品脂肪的測定》(GB/T 5009.6—2016)索氏抽提法[11]檢測粗脂肪含量。

1.3.2.4 肝臟、血清抗氧化和脂代謝指標的測定

取肝臟2 g，剪碎并研磨后與18 mL的4 ℃生理鹽水混勻并于均質袋中使用SCIENTZ-11型均質機拍打均質15 min得到肝臟勻漿液；將肝臟勻漿液和1.3.1血液樣品在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，分別取上清液于離心管中，4 ℃冰箱保存備檢。使用7080E型全自動生化分析儀(automatic chemistry analyzer，ACA，日本HITACHI)嚴格按照試劑盒的操作步驟測定肝臟和血清中TC、TG、HDL、LDL、MDA含量及SOD、GSH-Px活性和T-AOC，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 微生態制劑對種母雞生產性能的影響

由表2可知，各組間平均蛋重均無顯著差異(P>0.05)；與空白組相比，KL1組、Liu-c1組和復合組產蛋率分別極顯著增加5.77%、5.37%和8.84%(P<0.01)；KL1組、Liu-c1組和復合組種蛋合格率分別極顯著提高12.65%、9.15%和14.43%(P<0.01)；各組間平均日采食量無顯著差異(P>0.05)，試驗組平均日采食量均小于空白組，而KL1組料蛋比顯著降低2.27%(P<0.05)，Liu-c1組和復合組極顯著降低4.09%和5.45%(P<0.01)。微生態制劑對于種母雞產蛋率、種蛋合格率和料蛋比的優化中，復合組效果最佳。

表2 微生態制劑對種母雞產蛋性能的影響

2.2 微生態制劑對種母雞肝臟組織切片和粗脂肪含量的影響

肝臟油紅O染色觀察結果如圖1所示，空白組可見大量紅染脂肪滴，KL1組、Liu-c1組和復合組紅染脂肪滴減少。肝臟粗脂肪含量如圖2所示，KL1組、Liu-c1組和復合組的粗脂肪含量較空白組皆顯著降低(P<0.05)，表明3種微生態制劑皆具有較強的抑制產蛋后期種母雞脂肪肝、減少脂肪堆積的能力。

圖1 肝臟油紅O染色切片

2.3 微生態制劑對種母雞肝臟和血清抗氧化指標的影響

由表3可知，與空白組相比，KL1組血清、肝臟MDA含量分別極顯著減少39.13%和52.58%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少16.52%和37.32%(P<0.05)，復合組則分別極顯著減少34.78%和48.97%(P<0.01)；KL1組血清、肝臟SOD活性分別極顯著增加42.42%和57.65%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加25.60%和23.16%(P<0.05)，復合組則分別顯著增加31.53%和26.28%(P<0.05)；KL1組血清、肝臟GSH-Px活性分別極顯著增加33.51%和94.61%(P<0.01)，Liu-c1組則分別增加14.16%(P>0.05)和39.13%(P<0.05)，復合組則分別增加18.28%(P>0.05)和42.72%(P<0.05)；KL1組血清、肝臟T-AOC分別極顯著增加47.22%和57.42%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加25.00%和12.26%(P<0.05)，復合組則分別顯著增加27.78%和26.45%(P<0.05)。這2種微生態制劑單獨和復合時能不同程度地增加種母雞的抗氧化能力，其中KL1組效果最佳，復合組其次。

2.4 微生態制劑對種母雞血清和肝臟脂代謝指標的影響

由表4可知，與空白組相比，KL1組血清和肝臟TC含量分別極顯著減少42.73%和40.16%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少23.55%和25.20%(P<0.05)，復合組則分別極顯著減少26.74%和33.86%(P<0.01)；KL1組血清和肝臟TG含量分別極顯著減少30.14%和70.70%(P<0.01)，Liu-c1組則分別極顯著減少22.27%和45.05%(P<0.01)，復合組則分別極顯著減少27.59%和47.25%(P<0.01)；KL1組血清和肝臟LDL-C含量分別極顯著減少41.26%和35.00%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少32.87%和19.00%(P<0.05)，復合組則分別顯著減少34.97%和22.00%(P<0.05)；KL1組血清和肝臟HDL-C含量分別極顯著增加44.62%和123.08%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加29.23%(P<0.05)和極顯著增加84.62%(P<0.01)，復合組則分別顯著增加36.92%和115.38%(P<0.01)。這表明副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1單獨和復合使用皆有較好地降血脂功能，以KL1組效果最好，復合組次之。副干酪乳桿菌KL1能調節肝臟脂質合成和分泌之間的平衡，顯著改善肝臟脂肪堆積，有效抑制種母雞脂肪肝的形成。

3 討 論

3.1 微生態制劑對種母雞的生產性能的影響

產蛋量和蛋合格率是反映種母雞產蛋性能的重要指標。由于種母雞周齡的增加，產蛋性能不可避免地逐漸下降，降低生產經濟效益。戴維等[12]在蛋雞飼糧中添加3%復合微生態制劑可提高飼料利用率、抗氧化性能。Y?rük等[13]在飼糧中添加微生態制劑顯著提高種母雞產蛋后期的產蛋量，降低種母雞料蛋比。褚素喬等[14]在飼糧中添加1%枯草芽孢桿菌，羅曼褐蛋雞產蛋率和平均蛋重分別提高1.32%和4.14%，料蛋比降低4.65%，與Abdelqader等[15]和蔣一秀等[16]試驗結果基本一致。本試驗中，復合微生態制劑對于種母雞生產性能效果最佳。這是因為復合微生態制劑一方面通過自身合成的中性蛋白酶和淀粉酶，在功能上與種母雞內源消化酶具有互補性[17]，進入腸道后會消耗游離氧，進行腸道繁殖，從而調節腸道內微生物的菌群平衡，促進腸道內營養物質的消化吸收；另一方面復合組產生的膽鹽水解酶和胞外多糖具有抗脂質過氧化的作用，提高種母雞免疫和抗病能力。正是由于2種單一的微生態制劑益生機理相互疊加，復合微生態制劑提高種母雞的生產性能，降低料蛋比具有明顯優勢。

數據柱標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 微生態制劑對種母雞肝臟和血清抗氧化指標的影響

表4 微生態制劑對種母雞血清和肝臟脂代謝指標的影響

3.2 微生態制劑對種母雞的抗氧化能力的影響

活細胞抗氧化系統的第1道防線負責抑制自由基的生成和脂質過氧化，過量的自由基可損傷蛋白質、核酸等生物大分子物質，并產生大量的MDA，從而誘發許多疾病的發生[18]，而經常攝入抗氧化物質能夠提高種母雞抗氧化防御能力，保持體內氧化還原平衡[19]。MDA是脂質過氧化反應終產物，能指示機體氧化損傷及老化[20]。SOD和GSH-Px是體內重要的抗氧化劑，T-AOC是衡量機體對自由基總體清除能力的指標[21-22]。聶彥芬等[23]研究證明副干酪乳桿菌KL1能顯著提高農大3號矮小雞血清中的SOD活性和T-AOC，增強機體抗氧化能力；彭豫東等[24]發現在石門土雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌，與對照組相比，300 mg/kg BS組石門土雞的血清SOD活性顯著提高，GSH-Px活性極顯著提高；張鑫等[25]發現添加微生態制劑試驗組的血液中SOD和GSH-Px活性與對照組相比顯著提高，MDA含量顯著降低。本試驗通過在飼糧中添加不同的微生態制劑研究京紅1號種母雞的血清和肝臟的抗氧化能力，結果顯示與對照組相比，KL1組、Liu-c1組和復合組種母雞血清和肝臟中的T-AOC皆不同程度提高，其中KL1組效果最佳。戴維等[12]研究表明，在飼糧種添加3% EM菌使羅曼粉蛋雞血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC分別提高0.20%、1.80%、65.99%，MDA含量降低14.88%，而本試驗添加副干酪乳桿菌KL1的種母雞血清SOD、 GSH-Px活性和 T-AOC分別提高42.70%、33.50%、47.22%，MDA含量降低39.10%，與李嘉懿等[9]和聶彥芬等[23]研究結果基本一致。這是因為副干酪乳桿菌KL1能夠高產(1 271 mg/L)胞外多糖(exopoly saccharides,EP)[26]，EP能夠清除機體二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和羥自由基或減少活性氧的產生，同時副干酪乳桿菌KL1可以直接或間接作用免疫細胞分泌各種細胞因子與免疫球蛋白，極顯著提高SOD、GSH-Px活性和T-AOC，加速清除MDA等脂質過氧化物，保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾，從而減少種母雞氧化應激損傷，維持機體的健康狀態[27-29]

3.3 微生態制劑對種母雞的肝臟脂代謝及降血脂能力的影響

種母雞在產蛋期間體內需要合成大量的脂類來形成蛋黃[30]，特別容易誘發種母雞的脂質代謝紊亂，從而誘發種母雞FLS。患有FLS的病雞在脂肪的堆積過程中，導致肝臟樣變性，產蛋量急劇下降，且在產蛋后期更為嚴重[31]。姜延騫[32]在人工干預使其患有FLS的模型雞試驗中，其產蛋率由87%下降至45%，產蛋水平下降接近50%。本試驗通過在飼糧中添加不同的微生態制劑研究京紅1號種母雞的降血脂能力和肝臟脂代謝，與對照組相比，KL1組和復合組對降低種母雞血清和肝臟TC、TG含量以及提高HDL含量皆有極顯著的作用。韋云路等[33]研究表明，植物乳桿菌LPL-1使高脂大鼠血清TC和TG含量分別降低10.1%和11.5%，而本試驗種母雞血清TC和TG含量分別降低42.7%和30.1%。目前促進體內膽固醇分解最直接途徑是增加糞便膽汁酸的排泄[34]，膽汁酸在人體內主要以牛磺膽酸和甘氨膽酸2種結合態形式存在。副干酪乳桿菌KL1產生的膽鹽水解酶(bile salt hydrolase,BSH)一方面水解結合型膽鹽，產成游離型膽鹽和氨基酸[35]，前者與膽固醇生成共沉淀復合物，隨糞便排出體外，而降低血清膽固醇的含量；另一方面由于減少了游離態膽鹽在肝腸循環次數，增加膽鹽的生物合成，加速膽固醇的代謝，從而降低血清膽固醇的含量[36]。此外，油紅O染色肝臟組織切片觀察及粗脂肪含量測定證明副干酪乳桿菌KL1微生態制劑能夠減少種母雞脂肪堆積，降低LDL含量，具有保護肝臟和抑制脂肪肝形成的功效。

4 結 論

① 飼糧中添加微生態制劑可提高種母雞的生產性能，降低種母雞血清和肝臟中的TG含量、肝臟粗脂肪含量，提高血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA含量。

② 副干酪乳桿菌KL1微生態制劑對于提高種母雞抗氧化能力、降低血脂和膽固醇含量、保護肝臟效果最好；復合微生態制劑提高產蛋性能，抗氧化和降血脂能力具有明顯優勢，為復合微生態制劑在種母雞生產應用提供科學的理論與實踐依據。