葡萄糖氧化酶對產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能及抗氧化能力的影響

李嘉輝 李生杰 龔建剛 荊佳林 郝艷霜 馮志華* 趙國先*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001；2.合肥正大有限公司，合肥 230601；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071001)

蛋種雞的飼養(yǎng)周期相對較長，產(chǎn)蛋后期種雞生理機(jī)能逐漸退化，同時由于集約化養(yǎng)殖環(huán)境中各種應(yīng)激因素的影響，雞群常處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，對疾病的抵抗力減弱，產(chǎn)蛋性能和孵化性能大幅降低，利用年限縮短，提高了養(yǎng)殖難度和養(yǎng)殖成本。因此，研究高效綠色飼料添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋種雞繁殖性能和抗氧化能力的影響對于提高蛋種雞的利用率、延遲蛋種雞下架時間和提高種禽飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)作為一種功能性飼料添加劑，具有無殘留、無抗藥性、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。已有研究表明，GOD可降低動物腸道pH，改善腸道健康，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用，提高畜禽生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和免疫功能[1-7]。然而目前有關(guān)GOD在種禽上的研究甚少，其對產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能和抗氧化能力方面的研究還未見報道。因此，本試驗通過在產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼糧中添加不同水平的GOD，探究其對蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能、抗氧化能力及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為GOD的抗氧化作用機(jī)制研究及其在種雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GOD購自寧夏某有限公司，活性為1 200 U/g。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素隨機(jī)試驗設(shè)計，選用480只55周齡、體重和產(chǎn)蛋率基本一致的海蘭褐蛋種母雞，隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加200、350和500 mg/kg GOD的試驗飼糧。預(yù)試期1周，正試期12周。

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

參照NRC(1994)蛋種雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)生產(chǎn)情況配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組試驗雞于半機(jī)械通風(fēng)舍內(nèi)使用3層階梯籠養(yǎng)，自由采食和飲水，每隔5 d人工授精1次，每天人工光照16 h，光照強(qiáng)度為20 lx。試驗期間各組試驗雞均保持相同的環(huán)境條件，并按常規(guī)飼養(yǎng)管理規(guī)程及免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content豆油 Soybean oil2.00食鹽 NaCl0.35石粉 Limestone8.68磷酸氫鈣 CaHPO41.20氯化膽堿 Choline chloride (50%)0.10蛋氨酸 Met0.17預(yù)混料 Premix1)1.00合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)粗蛋白質(zhì) CP16.15代謝能 ME/(MJ/kg)11.40鈣 Ca3.60總磷 TP0.58非植酸磷 NPP0.30DL-蛋氨酸 DL-Met0.39賴氨酸 Lys0.73

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 產(chǎn)蛋性能及孵化性能指標(biāo)

產(chǎn)蛋性能：試驗期間每天15:00收集種蛋，記錄各重復(fù)產(chǎn)蛋數(shù)、總蛋重和采食量，并記錄破損蛋、軟殼蛋、沙殼蛋、雙黃蛋和畸形蛋等不合格蛋數(shù)。試驗結(jié)束后對各組產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和合格蛋率進(jìn)行統(tǒng)計。

產(chǎn)蛋率(%)=100×總產(chǎn)蛋數(shù)/(雞數(shù)×天數(shù))；平均蛋重(g)=總蛋重/總產(chǎn)蛋數(shù)；平均日采食量(g/d)=總采食量/(雞數(shù)×天數(shù))；料蛋比=總采食量/總蛋重；合格蛋率(%)=100×合格蛋數(shù)/產(chǎn)蛋數(shù)。

孵化性能：試驗最后1周，每個重復(fù)收集50枚合格種蛋進(jìn)行孵化指標(biāo)的測定，并于孵化第18天進(jìn)行照蛋，識別并撿出未受精種蛋，孵化過程中記錄各重復(fù)入孵蛋數(shù)、受精蛋數(shù)和出雛數(shù)，計算受精率、孵化率和出雛率。

受精率(%)=100×受精蛋數(shù)/入孵蛋數(shù);
孵化率(%)=100×出雛數(shù)/受精蛋數(shù);
出雛率(%)=100×出雛數(shù)/入孵蛋數(shù)。

1.4.2 蛋品質(zhì)

試驗第12周末，每重復(fù)隨機(jī)挑選5枚合格種蛋進(jìn)行蛋品質(zhì)測定。蛋形指數(shù)使用蛋形指數(shù)測量儀(NFN-385，以色列)進(jìn)行測定，蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度和哈氏單位使用多功能蛋品質(zhì)測定儀(EMT-5200)進(jìn)行測定，蛋殼厚度使用蛋殼厚度測量儀(ETG-1061型)測定。

1.4.3 血清及肝臟抗氧化指標(biāo)

試驗結(jié)束后，各組以重復(fù)為單位隨機(jī)選取2只接近平均體重的健康種雞，翅靜脈采血，3 000 r/min離心15 min后將血清分裝于離心管，置于-20 ℃保存。采血完成后將試驗雞屠宰并解剖，取適量相同部位的肝臟組織，生理鹽水沖洗后將分裝于5 mL離心管中，置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。使用試劑盒測定血清及肝臟丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)。所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 肝臟抗氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

樣品采集：在進(jìn)行1.4.3步驟的同時，額外取試驗雞2塊筋膜較少的相同部位的肝臟組織，分裝于1.5 mL凍存管后，迅速投入液氮，最后置于-80 ℃保存。

肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的測定步驟：1)使用超純RNA提取試劑盒(Cat#CW0581，CWbio. Co., Ltd.,)進(jìn)行總RNA提取；取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性。2)使用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(Cat#CW0744，CWbio. Co., Ltd.,)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。3)應(yīng)用Line Gene 9 600 Plus型PCR儀進(jìn)行熒光定量，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列(表2)由北京基譜生物科技有限公司設(shè)計并合成。

表2 實時定量PCR引物序列

1.4.5 經(jīng)濟(jì)效益計算

經(jīng)濟(jì)效益[元/(只·d)]=合格種蛋收入-
基礎(chǔ)飼糧成本-GOD成本。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能和孵化性能的影響

由表3可知，與對照組相比，350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的產(chǎn)蛋率顯著增加(P<0.05)，料蛋比顯著降低(P<0.05)；200、350和500 mg/kg GOD組總產(chǎn)蛋數(shù)分別較對照組增加1.92、3.12和3.85枚/只，總合格蛋數(shù)較對照組分別增加1.97、3.74和3.86枚/只；與對照組相比，200、350和500 mg/kg GOD組的種蛋受精率顯著增加(P<0.05)，但不同水平GOD添加組之間差異不顯著(P>0.05)；飼糧中添加不同水平GOD對平均日采食量、平均蛋重、合格蛋率、種蛋孵化率和出雛率均無顯著影響(P>0.05)。

表3 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能和孵化性能的影響

2.2 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞蛋品質(zhì)的影響

由表4可知，與對照組相比，350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的種蛋蛋殼厚度及哈氏單位顯著增加(P<0.05)；飼糧中添加不同水平GOD對種蛋的蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度和蛋形指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

表4 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的血清MDA含量顯著低于對照組、200和350 mg/kg GOD組(P<0.05)；與對照組相比，200、350和500 mg/kg GOD組的血清SOD活性和T-AOC顯著增加(P<0.05)，但不同水平GOD添加組之間無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，350和500 mg/kg GOD組的血清GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)。

2.4 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，與對照組相比，200、350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05)，肝臟SOD活性顯著增加(P<0.05)，但不同水平GOD添加組之間肝臟MDA含量和SOD活性無顯著差異(P>0.05)；350和500 mg/kg GOD組的肝臟GSH-Px活性顯著高于對照組和200 mg/kg GOD組(P<0.05)；飼糧中添加GOD對肝臟T-AOC無顯著影響(P>0.05)。

表5 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

表6 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由表7可知，飼糧中添加不同水平的GOD顯著上調(diào)了產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)；GOD添加組的肝臟Nrf2的mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)，但不同水平GOD添加組之間無顯著差異(P>0.05)；500 mg/kg GOD組的肝臟Cu/Zn-SOD的mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組和200 mg/kg GOD組(P<0.05)，但500與350 mg/kg GOD組之間無顯著差異(P>0.05)；GOD添加組的肝臟的Mn-SOD的mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，350與500 mg/kg GOD組之間無顯著差異(P>0.05)。

表7 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

2.6 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞經(jīng)濟(jì)效益的影響

由表8可知，飼糧中添加不同水平的GOD均能不同程度提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞的經(jīng)濟(jì)效益。在僅考慮飼糧成本的前提下，當(dāng)GOD的添加水平為500 mg/kg時利潤最高，每只雞每日盈利1.030元，與對照組相比增加8.42%。

3 討 論

3.1 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能和孵化性能的影響

處于產(chǎn)蛋后期的蛋雞，其本身生殖機(jī)能和抗氧化能力均有不同程度地減弱，而現(xiàn)代種雞養(yǎng)殖多采用高密度籠養(yǎng)，雞群常處于應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)蛋性能和種蛋質(zhì)量下降，孵化性能也顯著降低[8-9]。研究表明，活性氧引起的氧化應(yīng)激是機(jī)體衰老和卵巢功能衰退的主要機(jī)制之一[10-11]。因此，在飼糧中添加功能性添加劑可以緩解產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而改善其生產(chǎn)性能。趙必遷等[12]在產(chǎn)蛋后期羅曼粉殼蛋雞飼糧中添加300 mg/kg的GOD，發(fā)現(xiàn)顯著提高了產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率。曲浩杰等[13]在產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞飼糧中添加博落回提取物和GOD，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋率和料蛋比均有顯著改善。本研究結(jié)果與上述報道一致，飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD使產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋種雞的產(chǎn)蛋率和料蛋比得到顯著改善。目前有關(guān)GOD對種用畜禽繁殖性能影響的報道有限。在豬上的研究表明，妊娠期和哺乳期母豬飼糧中添加60 U/kg的GOD能夠改善母豬和仔豬的氧化還原狀態(tài)，提高母豬的繁殖性能[7]。另據(jù)報道，在34周齡蛋種雞飼糧中添加100 mg/kg的GOD對產(chǎn)蛋率、種蛋孵化率、受精率和健雛率等指標(biāo)均無顯著影響[14]。本研究中，飼糧中添加不同水平(200、350和500 mg/kg)GOD均顯著改善了種蛋受精率。試驗結(jié)果的差異可能歸因于試驗動物的種類、周齡、GOD的活性或添加水平不同。

表8 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞經(jīng)濟(jì)效益的影響

3.2 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞蛋品質(zhì)的影響

蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、哈氏單位和蛋形指數(shù)是衡量蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)。趙國先等[15]研究表明，在26周齡海蘭褐蛋雞飼糧中添加0.3%的GOD可顯著提高雞蛋的蛋殼厚度和哈氏單位。曲浩杰等[13]將GOD和博落回提取物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)對55周齡產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞的蛋殼厚度無顯著影響，但顯著提高了蛋白高度。本試驗中，飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD顯著提高了種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位，蛋殼強(qiáng)度也有所增加，但未達(dá)到顯著水平。研究結(jié)果的不同，可能與試驗動物的種類、產(chǎn)蛋階段、飼糧組成及養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關(guān)。蛋殼質(zhì)量不僅影響種蛋的運(yùn)輸安全，還會影響種蛋的孵化率[16]。哈氏單位是表示雞蛋新鮮程度和蛋白質(zhì)量的重要指標(biāo)，其與種蛋孵化率也密切相關(guān)[17]。研究表明，氧化應(yīng)激可抑制鈣離子在腸道內(nèi)的吸收，也會阻礙其在輸卵管殼腺部的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響蛋殼品質(zhì)[18-19]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD顯著改善了產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，這與種蛋的蛋殼質(zhì)量和哈氏單位得到顯著改善的結(jié)果相一致。此外，本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧中添加300和400 mg/kg的GOD可顯著提高蛋雞對鈣、總磷和粗蛋白質(zhì)等的消化率[5]。因此推測，GOD可能通過減輕產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善機(jī)體鈣、磷和蛋白質(zhì)代謝來提高種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞抗氧化能力的影響

血清及肝臟中GSH-Px、SOD活性和T-AOC、MDA含量都是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。GSH-Px和SOD作為機(jī)體酶促抗氧化系統(tǒng)的第1道防線，可消除自由基，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[20]。MDA為細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可參照其含量來間接估計機(jī)體所受氧化損傷的程度。T-AOC是體現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)[21]。宋海彬[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GOD可使肉雞血清SOD活性不同程度增加，MDA含量下降。Wang等[2]研究證實，GOD可顯著提高嶺南黃羽肉雞肝臟GSH-Px活性和T-AOC，顯著降低MDA含量，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。另有研究表明，飼糧中添加30 mg/kg的GOD(活性為10 000 U/g)顯著降低了臨武鴨血清MDA含量，添加水平為40 mg/kg時血清GSH-Px活性顯著增加，證實了GOD具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的作用[23]。本研究中，飼糧中添加350和500 mg/kg GOD均可使蛋種雞血清和肝臟GSH-Px、SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低，血清T-AOC顯著升高，與上述結(jié)果基本一致。由此可見，飼糧中添加350和500 mg/kg GOD能夠提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞機(jī)體的抗氧化酶活性，減輕脂質(zhì)過氧化水平，緩解其氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而改善種雞的產(chǎn)蛋性能、孵化性能和蛋品質(zhì)。

3.4 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路是機(jī)體抵御氧化應(yīng)激損傷的重要信號通路[24]，該通路中起關(guān)鍵作用的是Nrf2，可調(diào)控下游多種抗氧化酶的基因表達(dá)[25]。Keap1是Nrf2的抑制因子，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激源刺激時，處于細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與ARE結(jié)合，激活A(yù)RE相關(guān)二相酶的基因表達(dá)，降低細(xì)胞氧化損傷[26-27]。

Zhang等[28]研究表明，飼糧中添加含有GOD的益生菌后，仔豬肝臟Nrf2的mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著增加。本研究中，飼糧中添加GOD顯著提高了產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟Nrf2的mRNA相對表達(dá)量，同時Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA相對表達(dá)量也顯著增加，且血清和肝臟SOD活性表現(xiàn)出與肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量一致的規(guī)律性。這說明GOD可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞中Nrf2/ARE信號通路關(guān)鍵基因Nrf2的表達(dá)，以調(diào)節(jié)下游SOD等相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和高效表達(dá)，使得機(jī)體抗氧化酶活性增加，最終提高機(jī)體抗氧化能力。然而，GOD是否可通過激活Keap1感應(yīng)元件，調(diào)控Nrf2與Keap1解偶聯(lián)來調(diào)控下游抗氧化基因表達(dá)以及GOD抗氧化作用的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加350和500 mg/kg GOD可顯著改善產(chǎn)蛋后期蛋種雞的產(chǎn)蛋率和料蛋比，添加200、350和500 mg/kg GOD可顯著改善種蛋受精率。

② 飼糧中添加350和500 mg/kg GOD可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位。

③ 飼糧中添加GOD可提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞的血清和肝臟的抗氧化能力，激活肝臟細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。

④ 綜合經(jīng)濟(jì)效益分析，本試驗條件下，產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼糧中GOD的適宜添加水平為500 mg/kg。