牛樟芝多糖對脂多糖應激黃羽肉雞生長性能和空腸黏膜完整性的影響

葉金玲 范秋麗 林廈菁 王一冰 張 盛 茍鐘勇 蔣守群

(廣東省農業科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640)

在正常生理條件下，肉雞機體氧化與抗氧化常處于動態平衡中，但許多外源或內源性刺激均可導致機體處于氧化應激狀態，這對肉雞的健康養殖造成了嚴重的影響[1-2]。腸道是動物體內最重要的消化器官，也是體內第一個遭受到氧化損傷的器官。致病性大腸桿菌可以損傷雞腸道黏膜結構，導致氧化應激，進而影響腸道健康[3-4]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱作細菌內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁脂質雙分子層的外層結構，是構建腸道炎癥較好的激活劑[5-6]。眾多研究學者通過腹腔或靜脈注射LPS引發肉雞發生急性炎癥反應，并發現LPS還促進了炎癥細胞因子的產生和炎癥關鍵基因的表達[7-9]。

多糖主要是從植物、菌類等中提取的一種多聚糖，能夠提高機體免疫力和抗氧化水平，并具有抗腫瘤和抑菌等多種生物活性，同時具有安全低毒、無耐藥性、無污染和無殘留的特性[10-13]。研究表明，在飼糧中添加黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)和人參多糖均可以通過減輕LPS引起的免疫應激，改善腸道屏障功能，進而顯著提高斷奶仔豬的平均日增重(ADG)和飼料轉化率[12]；在飼糧中添加2 g/kg的枸杞多糖可以增強肉雞消化酶活性、抗氧化能力和免疫力，進而提高其生長性能[13]；在飼糧中添加1 000～4 000 mg/kg海藻多糖可促進肉雞生長性能的提高，增強其抗氧化性能，并從形態、抗氧化狀態和腸道黏膜通透性等方面改善腸道屏障功能[11]。因此，天然活性多糖是目前一種很有前途的可替代抗生素的飼料添加劑。研究證實，食藥用真菌子實體多糖、菌絲體多糖和胞外多糖具有較強的抗氧化活性，且主要通過清除氧自由基、激活細胞外信號等途徑發揮抗氧化作用[14]。牛樟芝(Antrodiacinnamomea)為我國臺灣地區特有的真菌品種，又有牛樟菇、樟芝、紅牛樟芝和血靈芝等諸多別名。多糖是牛樟芝的主要活性成分，且主體結構是葡萄糖，但其活性多糖是D-葡聚糖大分子結構[15]。雖然多糖在肉雞上的研究報道相對較多，但主要集中在APS、枸杞多糖和藻類多糖(algae-derived polysaccharide，ADP)等，牛樟芝多糖(Antrodiacinnamomeapolysaccharide，ACP)的研究報道較少。為此，本試驗擬研究ACP、APS和ADP對快大型黃羽肉雞生長性能和空腸黏膜完整性的影響，以期為ACP應用于肉雞生產，改善其腸道健康、促進生長和提高養殖效益提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LPS(血清型為O55∶B5，貨號L4005)購于Sigma公司；ACP(有效成分為D-葡聚糖，含量為76.3%)由臺灣某股份有限公司提供；APS(富含APS和黃芪甲苷，多糖含量為45%)購自北京某科技股份有限公司；ADP(有效成分為β-1,3-葡聚糖，含量為45%)購自珠海某科技有限公司。

1.2 試驗動物及設計

試驗在廣東省農業科學院動物科學研究所試驗場進行。選用1 200只健康狀況良好的9日齡快大型嶺南黃羽肉雞(母雛)，逐只稱重，根據體重一致原則分為8個組(每組6個重復，每個重復25只雞)，分別為：空白對照組(基礎飼糧)、LPS應激組(基礎飼糧+LPS應激)、抗生素組(基礎飼糧+LPS應激+20 mg/kg維吉尼亞霉素)、100 mg/kg ACP組(基礎飼糧+LPS應激+100 mg/kg ACP)、200 mg/kg ACP組(基礎飼糧+LPS應激+200 mg/kg ACP)、400 mg/kg ACP組(基礎飼糧+LPS應激+400 mg/kg ACP)、400 mg/kg APS組(基礎飼糧+LPS應激+400 mg/kg APS)和200 mg/kg ADP組(基礎飼糧+LPS應激+200 mg/kg ADP)。于18和20日齡，空白對照組每只雞腹腔注射0.50 mL的生理鹽水，其他組分別腹腔注射0.50 mL的LPS(500 μg/kg BW)。試驗期21 d。

1.3 飼養管理

試雞平養于封閉式雞舍，地面鋪放木屑，自由采食顆粒料和飲水，各組飼養管理和環境條件一致，按照常規操作程序和免疫流程進行飼養和免疫。試驗期間人工控制舍內光照，每天保持23 h光照，并自然通風。每天08:00、14:00和20:00記錄雞舍溫度和相對濕度。

1.4 基礎飼糧

試驗采用玉米-豆粕型基礎飼糧，根據《中國飼料成分及營養價值表2004年第15版》配制，其組成及營養水平見表1。基礎飼糧營養水平參考廣東省農業科學院動物科學研究所新制定的農業行業標準NY/T 3645—2020《黃羽肉雞營養需要量》科學配制。各組飼糧營養水平保持一致，抗生素和其他多糖添加劑按照不同添加水平等重量替代統糠。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(飼喂基礎)

續表1項目 Items含量 Content賴氨酸 Lys1.13蛋氨酸 Met0.45蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.87蘇氨酸 Thr0.83色氨酸 Trp0.25異亮氨酸 Ile0.86鈣 Ca1.00非植酸磷 NPP0.45

1.5 指標測定與方法

1.5.1 生長性能

試驗過程中，每天觀察雞只健康狀況，一旦出現死雞，立即稱死雞重和剩料量，以消除死雞對試驗結果的影響。記錄死雞數量，同時立即查明原因，采取適當措施。試驗開始和結束前1天19:00對試驗雞斷料、供水，次日07:00以重復為單位稱重，統計耗料量，計算平均日采食量(ADFI)、ADG、料重比(F/G)和存活率。

1.5.2 樣品的采集與指標檢測

1.5.2.1 常規指標檢測

于30日齡，每重復選取接近平均體重的2只雞,翅靜脈采血5 mL于加有肝素鈉的抗凝管，1 200×g離心10 min取上清。屠宰后取出空腸，用預冷的生理鹽水清洗內容物，縱向剖開，刮去內層黏膜裝入1.50 mL離心管中，-80 ℃保存。常規制備空腸組織勻漿液，按照體積比加入9倍體積預冷的生理鹽水，進行組織勻漿后低溫離心(4 ℃、12 000×g，10 min)，取上清。利用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)測定上清中總蛋白含量。利用黃嘌呤氧化酶法測定血漿總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；二硫代二硝基苯甲酸(DT-NB)比色法測定血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；鐵(Fe)氧化還原法測定血漿總抗氧化能力(T-AOC)；硫代巴比妥酸(TBA)法測定血漿丙二醛(MDA)含量，以上試劑盒購自南京建成生物工程研究所。采用放射免疫法測定上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)含量，所需試劑盒購自北京北方生物技術研究所。以上指標均在多功能酶標儀(Spectra max M-5，Molecular Devices，美國)上讀數，各指標具體檢測方法和結果計算均按照說明書進行。

1.5.2.2 空腸組織形態檢測

每組肉雞取出空腸后選取腸道中段1～2 cm用生理鹽水進行沖洗，將沖洗干凈的腸段放入提前準備好的4%多聚甲醛保存過夜，進行常規石蠟包埋后，采用蘇木精-伊紅(HE)進行染色處理，制成石蠟切片。采用Motic-BA210 Digital數碼顯微鏡對每組切片進行40×視野拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件以40×標尺為標準，每張切片選取5根最完整的絨毛，分別測量絨毛高度、隱窩深度和腸壁厚度，并計算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.5.2.3 空腸結構完整性相關基因表達檢測

空腸腸段清洗干凈剪成2段放于1.50 mL離心管，-80 ℃保存。總RNA的提取按照Trizol試劑盒說明書進行操作，利用Nano-Drop 2000微量核酸測定儀檢測RNA的總濃度和純度。RNA反轉錄嚴格按照試劑盒說明書進行。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(Bio-Rad CFX System)為20.0 μL體系：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL(10倍稀釋)，ddH2O 6.0 μL；每個樣品3個重復孔。從GenBank中獲得所測基因的序列取保守區域設計引物，并選用管家基因β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因。所需引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，并用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 數據統計分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，在差異顯著的基礎上進行Duncan氏法多重比較，顯著水平為P<0.05。試驗結果均以“平均值±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 ACP對LPS應激黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞末重、ADFI和ADG顯著降低(P<0.05)，而飼糧添加不同多糖對肉雞生長性能無顯著影響(P>0.05)。與LPS應激組相比，其他組肉雞ADFI均顯著提高(P<0.05)，且飼糧添加200 mg/kg ADP顯著提高肉雞ADG(P<0.05)。與抗生素組相比，飼糧添加不同多糖對肉雞末重、ADFI和ADG均無顯著影響(P>0.05)。此外，飼糧添加不同多糖組之間肉雞生長性能均無顯著差異(P>0.05)。

表3 ACP對LPS應激黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 ACP對LPS應激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

由表4可知，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞血漿中T-AOC顯著降低(P<0.05)，血漿和空腸黏膜中MDA含量顯著提高(P<0.05)。與LPS應激組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP顯著提高了肉雞血漿和空腸黏膜中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC(P<0.05)，飼糧添加ACP顯著降低了血漿和空腸黏膜中MDA含量(P<0.05)。與空白對照組或抗生素組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP和400 mg/kg APS顯著提高了肉雞血漿和空腸黏膜中GSH-Px活性(P<0.05)，但對二者中T-SOD活性、T-AOC和MDA含量沒有顯著影響(P>0.05)。飼糧添加不同多糖各組肉雞血漿和空腸黏膜中T-SOD活性、T-AOC和MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 ACP對LPS應激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜炎癥因子的影響

由表5可知，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞血漿中TNF-α和IFN-γ含量顯著提高(P<0.05)，空腸黏膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著提高(P<0.05)，空腸黏膜中抗炎因子IL-10含量顯著降低(P<0.05)。與LPS應激組相比，飼糧添加抗生素、ACP和APS顯著降低了血漿中TNF-α和IFN-γ含量(P<0.05)，飼糧添加ACP和APS顯著降低了空腸黏膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量(P<0.05)，但只有飼糧添加100 mg/kg ACP顯著提高了空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)。與抗生素組相比，只有飼糧添加400 mg/kg ACP顯著降低了空腸黏膜中TNF-α含量(P<0.05)。除空腸黏膜中TNF-α含量外，不同ACP組間血漿和黏膜中炎癥因子含量均無顯著差異(P>0.05)，400mg/kg ACP組、400mg/kg APS組和200 mg/kg ADP組3個組之間血漿和黏膜中炎癥因子含量也沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 ACP對LPS應激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

表5 ACP對LPS應激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜炎癥因子的影響

續表5項目 Items組別 Groups空白對照Blank controlLPS應激LPS stress抗生素Antibiotics100 mg/kg ACP200 mg/kg ACP400 mg/kg ACP400 mg/kg APS200 mg/kg ADP干擾素-γ IFN-γ8.51±0.659.40±0.558.88±1.018.41±1.138.39±0.607.95±1.028.64±0.788.69±0.73白細胞介素-1β IL-1β2.47±0.21b3.33±0.14a2.28±0.25bc1.83±0.23c2.11±0.13bc1.99±0.11bc2.35±0.12b2.29±0.19bc白細胞介素-6 IL-62.90±0.18b4.03±0.18a3.43±0.36ab3.00±0.30b3.16±0.26b3.01±0.26b3.26±0.13b3.53±0.28ab白細胞介素-10 IL-109.48±0.74a7.35±0.35b8.66±0.86ab9.60±1.22a9.18±0.72ab8.92±0.57ab8.98±0.57ab8.45±0.50ab

2.4 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸組織形態的影響

如圖1所示，30日齡時，空白對照組肉雞空腸黏膜結構完整，層次清晰，腸絨毛排列整齊，絨毛間及隱窩之間界限分明。相較于空白對照組，30日齡時，LPS應激組肉雞腸壁厚度增加，空腸黏膜結構紊亂、疏松，腸絨毛變短、破損，腸絨毛上皮細胞壞死、脫落，隱窩深度增加，且出現肥大，提示LPS可能影響位于隱窩部位的腸道干細胞進而影響隱窩部位細胞增殖分化，最終導致絨毛結構受損。相較于LPS應激組和抗生素組，不同ACP組肉雞表現為空腸絨毛高度增加、隱窩深度降低以及使腸壁變薄，并且其腸絨毛更加完整。相較于各ACP組和400 mg/kg APS組，200 mg/kg ADP組肉雞空腸黏膜結構完整性較差。

由表6可知，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞空腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著增加(P<0.05)，絨隱比顯著降低(P<0.05)，腸壁厚度顯著增加(P<0.05)；各ACP組和400 mg/kg APS組空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均沒有顯著差異(P>0.05)。與LPS應激組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸絨毛高度顯著增加(P<0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)；200 mg/kg ADP組空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著增加(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)。與抗生素組相比，各ACP組和APS組的空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)。與200 mg/kg ADP組相比，100 mg/kg ACP組空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著增加(P<0.05)。各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均無顯著差異(P>0.05)。

2.5 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸炎癥反應和屏障功能相關基因mRNA相對表達量的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞空腸Toll樣受體4(TLR4)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)。與LPS應激組和抗生素組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸TLR4、NF-κB和IL-1β的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，但空腸TNF-α的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。與抗生素組相比，200 mg/kg ADP組空腸TLR4、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)，但空腸NF-κB的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與空白對照組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)；各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖1 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸組織形態的影響

表6 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸組織形態的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，LPS應激組肉雞空腸黏蛋白2(MUC2)、封閉蛋白-1(claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和閉鎖蛋白(occludin)mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與LPS應激組相比，各ACP組空腸MUC2、claudin-1、ZO-1和occludin mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，400 mg/kg APS組空腸MUC2、claudin-1和occludin mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，200 mg/kg ADP組空腸claudin-1 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP顯著提高空腸MUC2、claudin-1和occludin mRNA相對表達量(P<0.05)。與空白對照組相比，ACP組和400 mg/kg APS組空腸MUC2、ZO-1和occludin mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)，200 mg/kg ADP組空腸claudin-1、ZO-1和occludin mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸以上基因的mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

A：空白對照；B：LPS應激；C：抗生素；D：100 mg/kg ACP；E：200 mg/kg ACP；F：400 mg/kg ACP；G：400 mg/kg APS；H：200 mg/kg ADP。數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。

圖3 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸屏障功能相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 ACP對LPS應激黃羽肉雞生長性能的影響

研究認為，多糖如枸杞多糖[13]、APS[16]和牛膝多糖[17]能改善肉雞生長性能；也有研究發現，蘑菇多糖和螺旋藻多糖的應用效果不明顯[9,18]。此外，研究表明，金針菇菇腳多糖(1 000 mg/kg)能顯著提高愛拔益加(AA)肉雞28～42日齡的ADG，顯著降低F/G，且在試驗末期(43～49日齡)不添加的情況下仍發揮降低F/G的作用[19]。Shang等[20]研究發現，在AA肉雞飼糧中添加小刺猴頭菌多糖后，ADG和ADFI隨著添加水平的提高均呈線性和二次曲線提高，但各組間(0、1、3和5 g/kg)F/G無顯著差異。在科寶(Cobb)肉雞飼糧中添加螺旋藻可以增強熱應激肉雞的體液免疫反應，提高其抗氧化能力，但對其生長性能無顯著影響[21]。但是，在羅斯(Ross)308肉雞飼糧中添加螺旋藻后，8～21日齡、22～35日齡和1～35日齡的總增重、F/G和歐洲生產效率指數也都隨其添加水平的提高呈線性提高[22]。以上結果表明，多糖對肉雞生長性能的影響可能受動物品種、生長階段和環境的影響。本試驗結果表明，肉雞注射LPS對F/G沒有顯著影響，這與馬邯生等[23]和吳亞男等[24]的研究結果一致。其原因可能是LPS通過應激抑制了動物采食中樞的局部興奮性，導致了采食量的降低，但采食量降低的同時也加快了機體分解代謝，導致ADG降低，致使F/G沒有發生顯著性變化。本研究中，與空白對照組相比，飼糧添加不同水平ACP對肉雞ADG、ADFI和F/G均無顯著影響，但卻一定程度上緩解了LPS對肉雞生長的抑制作用。這表明，ACP可以有效改善LPS應激狀態下肉雞的生長性能，但卻沒有劑量依賴性，且從添加水平上對比其作用效果優于APS和ADP；而與抗生素相比差異不顯著，說明ACP與抗生素對肉雞生長性能的作用效果基本一致。

3.2 ACP對LPS應激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA是評價機體抗氧化能力的重要指標[11-13]。研究發現，在嶺南黃羽肉雞53、56和59日齡時腹腔注射LPS(500 μg/kg BW)后，顯著降低了血清中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，并且具有提高血清中MDA含量的趨勢[25]。本試驗研究也發現，LPS應激顯著降低了30日齡肉雞血漿中T-AOC，顯著提高了血漿中MDA含量，這與前人研究結果基本一致。其結果差異性可能與肉雞注射LPS的次數和日齡有關，本試驗中在肉仔雞在18和20日齡時分別注射LPS，機體發育沒有53、56和59日齡時完善，所以試驗期間肉雞經受了明顯的氧化應激，導致血漿中脂質過氧化的終產物MDA含量發生了顯著變化，具體機制有待進一步研究。

研究發現，飼糧添加海藻多糖可顯著提高肉雞血清中T-AOC以及SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量，從而提高肉雞的抗氧化能力，且效果優于抗生素[26]。萬順康等[18]研究發現，飼糧添加螺旋藻多糖能顯著提高AA肉雞血清中T-SOD和GSH-Px活性，通過抑制其體內羥自由基、超氧陰離子自由基的產生，從而顯著降低血清中MDA含量。此外，螺旋藻還可以通過提高Cobb肉雞血清SOD和GSH-Px活性，降低血清MDA含量，進而增強熱應激刺激下機體的抗氧化能力[21]。研究發現，APS對氫化可的松誘導產生的氧化應激具有一定的干預作用，能夠提高AA肉雞血清中T-SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量[27]。本試驗結果與上述報道基本一致，與LPS相比，多糖顯著提高了肉雞血漿中T-SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，并顯著降低了血漿中MDA含量，其中100 mg/kg ACP與400 mg/kg APS之間相比無顯著差異，并且ACP、APS和ADP的作用效果要優于抗生素。

研究發現，多糖還可以提高肉雞[11]和鼠[28]的腸道抗氧化能力。本試驗結果也表明，與LPS相比，ACP顯著提高了空腸黏膜中T-SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，并顯著降低了空腸黏膜中MDA含量。值得注意的是，ACP和APS各組間相比對肉雞空腸黏膜抗氧化能力無顯著差異。這提示ACP緩解了LPS對腸道的氧化損傷但沒有劑量依賴性，且其效果優于抗生素和ADP。

總而言之，ACP可能是通過增強機體抗氧化酶的活性，減少LPS對腸道的氧化損傷，進而改善LPS氧化應激狀態下肉雞的生長性能且效果優于抗生素、APS和ADP。

3.3 ACP對LPS應激黃羽肉雞空腸組織形態的影響

腸道結構的完整性是保證其正常生理功能的前提條件，如果破壞不但會影響腸道功能的發揮，還會影響肉雞的健康和生長性能，甚至影響食品安全和人類健康[4,11,29]。研究發現，應激反應(飲用氫化可的松水或肌肉注射環磷酰胺)可造成肉雞小腸黏膜氧化損傷，降低腸絨毛高度、絨隱比和絨毛表面積[30-31]。與應激組(飲用氫化可的松水)相比，飼糧添加APS顯著提高肉雞小腸絨毛高度和寬度、黏膜厚度、絨隱比和絨毛表面積，且以0.40%的低劑量添加組效果突出，表明其對氧化應激有一定的抑制作用[30]；飼糧添加APS也可顯著提高環磷酰胺應激肉雞空腸絨毛高度、絨隱比以及腸道上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量[31]。此外，肉雞飼喂APS和黃芪總皂苷后，還可減少大腸桿菌引起的腸組織損傷和炎癥反應，改善腸道免疫力，增強抗感染能力[3]。本試驗結果顯示，30日齡時，LPS應激組肉雞腸黏膜結構損傷嚴重，與上述報道基本一致。同時，也提示LPS可能影響位于隱窩部位的腸道干細胞進而影響隱窩部位細胞增殖分化，最終導致絨毛結構受損。此外，本試驗中，ACP和APS表現為提高空腸絨毛高度、降低隱窩深度以及使腸壁厚度變薄，而ADP組和抗生素組空腸黏膜結構完整性相對較差。由此可見，不同活性多糖對LPS誘導的肉雞空腸損傷均具有保護作用，且初步推斷ACP和APS能夠增強腸道功能，其中，100 mg/kg ACP對腸黏膜修復作用最佳。

3.4 ACP對LPS應激黃羽肉雞炎癥反應和腸道屏障功能的影響

研究發現，LPS可以結合細胞表面的TLR4，進而活化NF-κB信號通路，介導促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等參與炎癥反應進程[32-33]。大腸桿菌感染肉雞后，空腸中促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBmRNA的表達量顯著上調[34]。在炎癥反應導致細胞因子增加后，APS可以減少炎癥反應因子，保護細胞或身體[35-36]。研究發現，APS還能提高環磷酰胺應激肉雞空腸中抗炎因子白細胞介素-2(IL-2)和IL-10的表達[31]。體外研究發現(Caco2細胞模型)，添加APS可以有效緩解LPS感染的Caco2細胞的炎癥反應，顯著下調TNF-α、IL-1β和白細胞介素-8(IL-8)的表達[37]。進一步研究發現，APS通過抑制LPS誘導的NF-κB的激活，抑制TNF-α和IL-1β的表達[38]。另有研究也表明，APS對大腸桿菌的毒力減弱，其修復機制可能是通過TLR4/NF-κB信號通路介導的[39]。本試驗結果與以上研究結果基本一致，LPS顯著提高了血漿和空腸黏膜中炎癥因子的表達，引發了肉雞的炎癥反應，成功建立了應激模型；ACP、APS和ADP顯著降低了LPS誘導的血漿和空腸黏膜中炎癥因子的表達；只有100 mg/kg ACP顯著降低了血漿中炎癥因子TNF-α的含量，并顯著提高了空腸黏膜中抗炎因子IL-10的含量。由此可見，不同多糖有效緩解了LPS誘導的肉雞血漿和空腸黏膜損傷，但只有100 mg/kg ACP同時發揮了抑制炎癥因子和促進抗炎因子的雙重作用，有效修復了LPS誘導的炎癥損傷。其作用機制可能與APS類似，即通過抑制LPS誘導的TLR4/NF-κB表達，進而抑制炎癥因子的表達，最終發揮修復炎癥損傷的功能。

此外，LPS不但會提高炎癥因子的表達，而且還會影響腸道屏障功能[40]。由于腸道健康很大程度上也取決于腸道黏膜屏障是否完整，TLR4表達增加通常也與腸道屏障的衰竭有關[41-42]。緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的重要部分，它們主要由MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1[33,43]。MUC2是腸黏膜表面黏液的主要成分，可修復有害因素引起的腸黏膜膜損傷[44]。MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1的mRNA相對表達量的下調會對腸道結構和屏障功能造成損害。因此，本試驗進一步研究了腸道屏障功能關鍵基因MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1的表達，結果顯示ACP和APS顯著提高了LPS應激狀態的空腸屏障功能關鍵基因mRNA相對表達量，其作用效果優于抗生素和ADP。

4 結 論

綜上所述，在快大型嶺南黃羽肉雞基礎飼糧中添加ACP，可有效緩解LPS誘導的生長抑制、氧化損傷和腸道結構損傷，且效果優于抗生素；其作用機制可能與APS類似，即通過抑制LPS誘導的TLR4/NF-κB表達，進而抑制炎癥反應的發生，提高機體抗氧化能力并增強腸道黏膜屏障功能，充分發揮修復炎癥損傷的功能；由于ACP不存在添加劑量依賴性，建議添加100 mg/kg。