酶菌復合制劑對肉雞生長性能、免疫功能和抗氧化功能的影響

陳丹蝶 彭 翔 張廣民 陳凱旋 蘇艷芳 薩仁娜* 黃艷玲

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；3.天津博菲德科技有限公司，天津 300000)

目前，我國飼料生產已經進入全面禁用抗生素的時代，開發高效、綠色和安全的飼料添加劑，充分激發畜禽生產潛能，維持機體健康水平，以獲得較高的生產效率，是今后研究的目標，也是畜禽健康養殖發展的必然趨勢。近些年研究表明，益生菌、酶制劑和植物提取物等均有較好改善生產性能并起到替抗的作用。益生菌能夠增加腸道有益菌數量，減少有害菌數量，改善微生物平衡，激活動物免疫功能，提高腸道上皮黏膜完整性[1-3]，從而維持動物健康水平并提高生產性能[4]。其中，乳酸菌是最常用的也是公認安全的益生菌，在美國和中國均被批準使用。酶制劑一方面能夠補充畜禽體內消化酶分泌的不足；另一方面能夠通過降解抗營養因子，降低消化道食糜黏度，改善飼糧消化率，從而提高日增重和飼料轉化效率，是目前廣泛使用的添加劑之一[5-7]。其中，葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，在飼糧添加GOD能夠提高畜禽體重和飼料轉化效率，獲得與抗生素相近的促生長效果[8-10]；非淀粉多糖(non-starch polysaccharide，NSP)酶通過水解可溶性的NSP，降低消化道食糜黏度，從而改善飼糧消化率，提高養分利用率，提高采食量和日增重[11-12]；群體感應淬滅酶(quorum quenching enzyme，QQE)為群體感應抑制劑，能夠干擾病原菌群體感應，阻斷信號交流，影響致病因子的表達[13-14]，目前主要應用于水產養殖中[15]，在畜禽養殖中應用報道較少。益生菌和酶制劑是作用機理不同的2種添加劑，益生菌通過改善腸道形態及腸道免疫功能，起到促進畜禽健康的作用；酶制劑則通過改善飼糧結構提高養分消化率，起到促進畜禽生長的作用。單一菌(酶)或者復合菌(復合酶)均能對畜禽健康和生產性能起到促進作用。目前，酶菌聯合使用主要用于飼料原料的加工處理，如酶菌協同發酵豆粕[16-18]、酶菌協同發酵菜籽粕[19]，其通過降解大分子營養物質，降低抗營養因子含量，改善飼糧消化率，提高畜禽生長性能。酶制劑與益生菌作為安全的飼料添加劑，兩者進行配伍組合，對畜禽生產性能是否具有疊加作用，或者具有相互抵消的作用，這方面研究報道較少。因此，本試驗在肉雞飼糧中添加不同配伍組合的酶菌復合制劑，并以抗生素作為對照，研究組合制劑對肉雞生長性能、免疫功能和抗氧化功能的影響，為酶菌配伍使用以及替代抗生素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為科寶白羽肉雞。抗生素預混劑為金霉素(含量為15%)與吉他霉素(含量為50%)；益生菌為包被乳酸菌，活菌數為1×1012CFU/g；酶制劑分別為NSP酶(酶活性為2 000 IU/g)、GOD(酶活性為1 000 IU/g)和QQE(酶活性為10 000 IU/g)。其中，NSP酶由纖維素酶(>100 IU/g)、β-葡聚糖酶(>1 200 IU/g)、木聚糖酶(>6 000 IU/g)和β-甘露聚糖酶(>3 000 IU/g)組成。試驗基礎飼糧為玉米-豆粕型，參照NRC(1994)和《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)進行配制，其組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 試驗設計

試驗采用單因素隨機設計，選用1 120只1日齡健康科寶500雛雞，隨機分為4個組，每組10個重復，每個重復28只雞(公母各占1/2)。4個組分別為：1)空白對照組，飼喂基礎飼糧；2)抗生素組，在基礎飼糧中添加抗生素；3)酶菌復合制劑Ⅰ組，在基礎飼糧中添加酶菌復合制劑Ⅰ；4)酶菌復合制劑Ⅱ組，在基礎飼糧中添加酶菌復合制劑Ⅱ。具體分組情況及添加劑量見表2。試驗各組在同一棟雞舍內，采取立體籠養方式，3層籠只保留上層和中層進行飼養，每單籠飼養7只雞。試驗期為42 d，分為1～21日齡和22～42日齡2個階段。

表2 試驗設計

1.3 飼養管理

日常飼養管理按照飼養管理手冊進行。溫度、相對濕度和光照嚴格執行飼養手冊要求，光照為自然光照與人工光照，自由采食和飲水，每天清糞1次。肉雞免疫按常規程序進行，試驗期間各組飼養管理條件一致。

1.4 指標檢測

1.4.1 生長性能

每7 d以重復為單位，仔細稱量剩余飼料量，計算每周的耗料量。分別于21和42日齡，以重復為單位，空腹12 h后稱重，計算平均體重和平均耗料量，并計算1～21日齡、22～42日齡和1～42日齡的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 血液指標

試驗第42天，空腹稱重后每個重復取2只雞(接近平均體重)，翅靜脈取全血10 mL，3 500×g離心10 min，分離血清，-20 ℃凍存待測，分別測定抗氧化指標以及免疫球蛋白和細胞因子含量。

1.4.3 肝臟指標

試驗第42天，空腹稱重后每個重復取2只雞(接近平均體重)，翅靜脈取血后二氧化碳處死，取一小部分左側肝臟，-20 ℃凍存后測定細胞因子含量和抗氧化指標。取-20 ℃凍存的肝臟樣品，準確稱取0.5 g放入10 mL離心管中，快速加入10 mL生理鹽水，放入冷凍全自動碾磨儀中碾磨，制成勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，吸取上清液分裝，待測。

1.4.4 測定方法

血清和肝臟丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定，總抗氧化能力(T-AOC)采用微板法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作方法參考說明書進行。血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量采用免疫比濁法測定，所用試劑盒購自北京利得曼生化股份有限公司。血清和肝臟細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量采用酶聯免疫吸附試驗法測定，所需儀器為Multiskan MK3酶標儀，所用試劑盒購自中尚博奧生物科技有限公司。

1.4.5 糞便含氮物質

試驗第42天，以重復為單位，取新鮮糞便凍存。采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定糞便尿素含量，用脲酶法測定尿酸含量，用納氏試劑分光光度法測定氨態氮含量，儀器為日立7600全自動生化分析儀。

1.5 數據處理與分析

試驗數據采用SAS 9.2 Means模塊計算基本統計量，根據單因素隨機設計的基本原理，采用GLM模塊分析4個組間的差異顯著性，采用Duncan氏法進行多重比較。結果用平均值和均值標準誤(SEM)表示，以P<0.01為極顯著水平，P<0.05為顯著水平，0.05≤P<0.10為有變化趨勢。

2 結果與分析

2.1 酶菌復合制劑對肉雞生長性能的影響

由表3可知，1～21日齡，抗生素組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞末重和ADG顯著高于空白對照組和酶菌復合制劑Ⅰ組(P<0.05)，抗生素組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞末重和ADG之間無顯著差異(P>0.05)，空白對照組和酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞末重和ADG之間亦無顯著差異(P>0.05)；各組肉雞ADFI之間均無顯著差異(P>0.05)；抗生素組肉雞F/G顯著低于其他各組(P<0.05)，酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞F/G顯著低于空白對照組和酶菌復合制劑Ⅰ組(P<0.05)，空白對照組和酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞F/G之間無顯著差異(P>0.05)。22～42日齡和1～42日齡，各組肉雞生長性能指標之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 酶菌復合制劑對肉雞生長性能的影響

2.2 酶菌復合制劑對肉雞免疫功能的影響

由表4可知，各組肉雞血清IgA、IgG和IgM含量之間無顯著差異(P>0.05)，各組肉雞血清IL-1β和TNF-α含量之間無顯著差異(P>0.05)；與空白對照組相比，抗生素組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞血清IL-6含量顯著升高(P<0.05)，血清IL-10含量有升高的趨勢(0.05≤P<0.10)。各組肉雞肝臟細胞因子含量之間均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 酶菌復合制劑對肉雞抗氧化功能的影響

由表5可知，各組肉雞血清MDA含量、SOD活性和T-AOC之間均無顯著差異(P>0.05)；酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞血清GSH-Px活性顯著高于其他3組(P<0.05)，血清CAT活性顯著高于空白對照組和抗生素組(P<0.05)；酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞血清CAT活性顯著高于空白對照組(P<0.05)。與空白對照組相比，酶菌復合制劑Ⅰ組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞肝臟SOD活性顯著提高(P<0.05)；各組肉雞肝臟其他抗氧化指標之間均無顯著差異(P>0.05)。

表4 酶菌復合制劑對肉雞免疫功能的影響

表5 酶菌復合制劑對肉雞抗氧化功能的影響

2.4 酶菌復合制劑對肉雞糞便含氮物質含量的影響

由表6可知，各組肉雞糞便中尿素和氨態氮含量之間均無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比，抗生素組、酶菌復合制劑Ⅰ組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞糞便中尿酸含量顯著降低(P<0.05)，且抗生素組、酶菌復合制劑Ⅰ組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞糞便中尿酸含量之間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 酶菌復合制劑對肉雞糞便含氮物質含量的影響

3 討 論

3.1 酶菌復合制劑對肉雞生長性能的影響

研究表明，酶制劑能夠提高1～21日齡肉雞生長性能并獲得與抗生素相近的促生長效果[10]；益生菌能夠改善生長前期肉雞的生長性能，提高ADG，并降低F/G[20-21]，而且其促進作用與抗生素相同[22]。本試驗結果顯示，與空白對照組相比，酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞1～21日齡ADG顯著提高，且與抗生素組差異不顯著，這表明酶菌復合制劑Ⅱ(QQE+GOD+乳酸菌)可以對家禽生長前期生長起到促進作用，達到與抗生素相類似的效果。同時，酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞生長性能與空白對照組無顯著差異，表明酶菌復合制劑Ⅱ促生長作用顯著優于酶菌復合制劑Ⅰ(NSP酶+GOD+乳酸菌)。研究表明，NSP酶作用效果與飼糧結構和NSP含量有關，NSP酶只在NSP含量高的飼糧中起到作用[23]。在小麥、大麥和黑麥飼糧中添加NSP酶，能夠降解植物細胞壁，降低消化道食糜黏度，從而提高動物生長性能[5,24-26]。而對于玉米-豆粕型飼糧，阿拉伯木聚糖是玉米中的主要NSP，其不易分解，常規的NSP酶(木聚糖酶)對其的降解能力有限[27-28]。因此，NSP酶在生產中的應用效果與飼糧結構、NSP含量和NSP酶組成有關。QQE是能夠降解群體感應信號產生群體淬滅效應的酶，其通過阻止病原菌產生毒性從而降低致病性[29-30]。QQE改善動物的生長性能可能與其降低了存在于養殖環境和腸道中潛在致病菌的毒性有關，類似于抗生素的抑菌作用。由此可見，NSP酶與QQE的作用途徑完全不同，NSP酶針對飼料原料，以改善飼糧的消化為主，且飼料的結構影響酶的發揮；而QQE針對潛在病原菌，通過降解群體信號而降低病原菌的致病性。在本試驗中，酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞的生長性能與空白對照組相近，表明NSP酶、GOD和乳酸菌三者進行復合后，并無累加作用，推測可能與飼糧結構有關；酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞的生長性能與抗生素組相近，表明QQE在促生長中發揮了主要作用。在對酶菌復合制劑的研究中，促生長作用存在差異。Murugesan等[31]研究表明，5種乳酸菌與木聚糖酶聯合使用，對1～21日齡肉雞體增重和采食量無顯著影響。Askelson等[32]研究表明，由3株解淀粉芽孢桿菌與淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶組成的復合制劑，能夠改善不同生長階段肉雞的飼料轉化效率。Wang等[33]研究表明，GOD與解淀粉芽孢桿菌聯合應用對黃羽肉雞生長性能無促進作用，也無累加作用。由此可見，酶菌配伍使用對畜禽生長性能的影響與飼糧結構、養分含量等有關，也與酶和菌的組成有關。本試驗結果表明，飼糧添加由QQE、GOD和乳酸菌復合而成的酶菌復合制劑能夠提高肉雞生長性能，達到與抗生素相近的效果。

此外，本試驗根據各組出欄體重、成活率以及飼料消耗，分析各組的經濟效益，其中基礎料價格按照3.4元/kg計算，雛雞按照4.5元/只計算，疫苗和人工等成本不參與計算，各組毛利潤=毛雞收入-飼料成本-雛雞成本，則抗生素組每只雞毛利潤比空白對照組增加了0.41元，酶菌復合制劑Ⅰ組比空白對照組增加了0.01元，酶菌復合制劑Ⅱ組比空白對照組增加了0.30元。因此，綜合本試驗生長性能和經濟效益的結果，在基礎飼糧中添加由QQE、GOD和乳酸菌復合而成的酶菌復合制劑能夠達到替代抗生素的效果。

3.2 酶菌復合制劑對肉雞免疫功能的影響

血液免疫球蛋白是經抗原誘導可轉化為抗體的蛋白質，是機體對抗原物質產生免疫應答的重要產物。本試驗結果顯示，各組肉雞血清免疫球蛋白含量無顯著差異，表明在正常條件下，酶菌復合制劑不會使機體產生抗體，這與單獨使用酶制劑或者益生菌的試驗結果略有差異。在前期的研究中，大部分結果顯示益生菌能夠提高機體免疫球蛋白含量，其中枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌的復合制劑能夠顯著提高斷奶仔豬血清中IgG和IgM的含量[34]；乳酸片球菌能夠提高生長豬血清中IgG和IgA的含量[35]。酶制劑對機體免疫功能影響的研究結果并不一致。陳瑾等[36]研究表明，GOD能夠顯著提高仔豬血清IgG含量；Li等[37]研究表明，甘露聚糖酶可降低肉雞血清IgG和IgM含量，抑制由甘露聚糖引起的免疫反應；Ferreira等[38]研究表明，甘露聚糖酶能夠降低肉雞血液中IgA、IgG和IgM的含量，減少免疫反應所消耗的營養物質；Arsenault等[39]研究表明，NSP酶能夠減輕飼料源性造成的腸道免疫反應。本試驗采用的是配伍復合制劑，含有活菌制劑，同時含有GOD與NSP酶(或QQE)，乳酸菌能夠促進免疫球蛋白的產生，酶制劑能夠消除飼料抗原物質，減少免疫球蛋白的產生，使機體抗體反應達到一種免疫平衡狀態，從而有利于飼糧養分充分用于生長，不過這一推測還需進一步驗證。

細胞因子是一組參與許多生理過程調節和免疫調節蛋白[40]。IL-1β、IL-6和TNF-α等能夠刺激細胞因子的分泌，增強免疫，為促炎性細胞因子，但分泌過多會對組織造成損傷，導致生長性能減弱。本試驗結果顯示，與空白對照組相比，抗生素組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞血清IL-6含量顯著升高，血清IL-10含量有升高的趨勢。IL-6是一種非特異性炎性細胞因子，IL-6含量的提高可誘發消化道黏膜的炎癥反應。IL-10是重要的負調節因子，可抑制巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和趨化因子。有研究報道，桿菌肽改善生長前期肉雞體增重和飼料轉化效率與回腸IL-6和白細胞介素-13(IL-13)表達量的升高有關[41]；GOD顯著提高仔豬血清TNF-α和IL-6含量，顯著降低白細胞介素-2(IL-2)含量[36]；屎腸球菌可促進RAW264.7細胞分泌IL-10[42]。本試驗與上述試驗結果相近，抗生素和酶菌復合制劑Ⅱ促進細胞因子IL-6分泌的同時提高IL-10含量，從而平衡機體炎性反應，避免產生過度炎性反應，減少免疫反應消耗的營養物質，從而提高動物生長性能，這與本試驗中抗生素和酶菌復合制劑Ⅱ顯著改善生長性能的結果一致。這也進一步表明，酶菌復合制劑Ⅱ中的QQE與抗生素相似，能夠降低環境中潛在致病菌對動物機體的危害，達到與抗生素相類似的抑菌和促生長效果。

3.3 酶菌復合制劑對肉雞抗氧化功能的影響

在正常情況下，動物機體氧化代謝產生的自由基被抗氧化防御系統清除，過多的自由基會引起組織和細胞損傷，影響內部環境的相對穩定性[43-44]。本試驗結果顯示，與空白對照組相比，酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞血清CAT和GSH-Px活性顯著提高，酶菌復合制劑Ⅰ組肉雞血清CAT活性顯著提高，酶菌復合制劑Ⅰ組和酶菌復合制劑Ⅱ組肉雞肝臟SOD活性顯著提高。本結果與單獨使用酶制劑或者益生菌的研究結果相近。研究表明，GOD對臨武鴨血清SOD和GSH-Px活性無顯著影響，高劑量GOD能夠降低血清MDA含量[45]；枯草芽孢桿菌能夠提高肥育豬血漿CAT活性，對肌肉抗氧化指標無顯著影響[46]；嗜酸乳桿菌能夠提高氧化應激仔豬小腸上皮細胞SOD和GSH-Px活性[47]。本試驗結果顯示，酶菌復合制劑Ⅱ的配伍組合，其抵抗體內自由基的能力強于酶菌復合制劑Ⅰ的配伍組合，二者作用機理有所差異。酶菌復合制劑Ⅱ中含有QQE，具有一定的抗菌功能，可能與GOD和乳酸菌的抗氧化性能有一定的疊加效應。酶菌復合制劑Ⅰ的作用效果與飼料原料結構以及活性物質的含量有關，在玉米-豆粕飼糧中所體現的抗氧化功能有限。對于酶菌組合產生的疊加抗氧化功能，還需要進一步深入研究。

3.4 酶菌復合制劑對肉雞糞便含氮物質含量的影響

家禽攝入的蛋白質等含氮物質最終產物是尿酸，因此糞尿混合物中含有較高的尿酸，這是體內蛋白質分解和腸道微生物共同作用的結果。本試驗結果顯示，與空白對照組相比，試驗組(抗生素組、酶菌復合制劑Ⅰ組和酶菌復合制劑Ⅱ組)肉雞糞便中尿酸含量顯著降低。分析其原因可能在于酶菌配伍組合在一定程度上能夠降低蛋白質的分解代謝，提高飼糧中含氮物質的利用率，減少其排出量，同時可能通過調節腸道微生物，減少降解氨基酸微生物的數量，使得糞尿混合物中尿酸含量降低。此外，本試驗的酶菌復合制劑中均含有乳酸菌，有可能會降低糞便pH，從而減少氨的產生。研究表明，小麥飼糧中添加木聚糖酶能夠提高肉雞回腸蛋白質利用率[48]；NSP酶能顯著降低肉鴨血清中尿素氮含量[49]；不同劑量GOD顯著降低臨武鴨血清尿素氮含量[45]；NSP酶能夠降低肉雞糞中尿酸含量[50]；飼糧添加丁酸梭菌顯著降低肉雞血清氨和尿酸含量[51]。本試驗與上述研究結果相近，酶菌復合制劑通過提高飼糧消化率，改善腸道吸收功能，從而減少糞便中含氮物質的含量。

4 結 論

飼糧添加由QQE、GOD和乳酸菌配伍組成的酶菌復合制劑能夠提高肉雞生長前期(1～21日齡)的生長性能，顯著提高血清IL-6含量，顯著提高血清CAT和GSH-Px活性以及肝臟SOD活性，顯著降低糞便中尿酸含量，可有效替代抗生素。