金霉素和乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬相對生長速率和糞便代謝產物的影響

楊運南 趙祖艷 劉日亮 張云龍 胡 浩 鄭衛江* 姚 文

(1.南京農業大學消化道生物實驗室，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京 210095； 2.江蘇遠山生物技術有限公司，鹽城 224001)

斷奶仔豬的消化和免疫系統尚未完全成熟，容易受外界刺激發生腹瀉與病原微生物感染，從而影響生長性能[1]。雖然在斷奶仔豬飼糧中添加促生長抗生素(antibiotic growth promoters，AGPs)能夠起到促進生長、降低腹瀉和提高飼料轉化率的作用，但細菌耐藥問題與畜產品抗生素殘留問題也在嚴重威脅著人們的健康[2]。因此，我國在2016年頒布《遏制細菌耐藥國家行動計劃》，以規范抗生素的管理與應用[3]。2020年7月1日，我國實行飼料端全面禁用AGPs。

金霉素是一種廣譜抑菌的四環素類抗生素，其具備降低腹瀉、提高飼料轉化率和促進生長的作用，是禁抗以前養豬業使用最多的AGPs[4]。益生元是一類能被宿主微生物選擇性利用并賦予宿主健康益處的底物[5]。乳果糖是由1分子半乳糖和1分子果糖組成的二糖，可以完整地到達后腸，供腸道微生物發酵[6]，改善宿主消化道內環境與優化消化道菌群組成[7]。Guerra-Ordaz等[8]研究發現，飼喂含10 g/kg乳果糖的飼糧能顯著提高斷奶仔豬平均日增重和飼料轉化率，并能同時降低腸桿菌和乳球菌的比例。Rycroft等[9]研究發現，相比于其他低聚糖，乳果糖具有促進雙歧桿菌增殖的作用。益生菌是一類在補充足夠量時能給宿主帶來健康益處的活微生物[10]。凝結芽孢桿菌是乳酸生成菌，它可以產生多種酶(如阿拉伯糖酶、α-淀粉酶和纖維素酶等)，以提高飼料利用率，促進動物生長[11]。此外，凝結芽孢桿菌還能以孢子形式在胃酸中存活，并在腸道中出芽發揮益生作用[11]。Wu等[12]研究發現，在斷奶仔豬飼糧中補充2×106或2×107CFU/g凝結芽孢桿菌能有效地降低仔豬腹瀉，改善腸道屏障功能及消化道微生物組成。合生素是益生菌和益生元的混合物，兼具益生菌和益生元的益生效果，被廣泛地用作飼料添加劑[13]。本課題組前期研究發現，在無抗飼糧中添加乳果糖和凝結芽孢桿菌合生素可降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高總能和粗脂肪表觀消化率，降低血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)含量，對斷奶仔豬料重比有一定改善作用[14]，但是其潛在的作用機制尚不明確。

代謝組學技術可以允許同時測量1個樣品中成千上萬個代謝產物與營養物，為研究營養效應和代謝產物間相互作用開辟了更多的可能性[15]。此外，代謝組學已經成為其他組學學科(尤其是基因組學、轉錄組學和蛋白質組學)的補充技術，能夠為更好地解答科學問題提供幫助。因此，在前期研究的基礎上，本試驗旨在評估乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬生長的影響，并同時借助代謝組學技術和氣相色譜法初探乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素的可能益生機制。雖然，本研究中基礎飼糧為無抗飼糧，但為了更好地評價乳果糖-凝結合生素作為潛在替抗添加劑的作用，還設定了金霉素添加組(在基礎飼糧中添加75 mg/kg金霉素)作為陽性對照。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

選取18頭健康且體重相近的27～28日齡“杜×長×大”閹公豬，初始體重(9.08±0.59) kg，隨機分成3組，每組6個重復，每個重復1頭豬。預試期7 d(飼喂基礎無抗飼糧)，正試期29 d。對照組(CTR組)飼喂基礎無抗飼糧，抗生素組(ANT組)飼喂基礎無抗飼糧+75 mg/kg金霉素，合生素組(SYN組)飼喂基礎無抗飼糧+合生素(10 g/kg乳果糖+2×109CFU/kg凝結芽孢桿菌)。試驗期間自由采食和飲水，漏縫地板，單欄單飼，定期通風與清理，室內溫度保持在22～23 ℃。斷奶仔豬飼養期間，未與處理外的其他抗生素接觸。本試驗所用飼糧參考NRC(2012)斷奶仔豬營養需要進行配制，飼糧組成及營養水平同趙祖艷等[14]。

1.2 試驗材料

乳果糖為杜密克乳果糖口服液(667 mg/mL，Abbott Biologicals B.V.，荷蘭)；凝結芽孢桿菌(活菌數1×109CFU/g)由江蘇某生物技術有限公司提供。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 相對生長速率(relative growth rate，RGR)

從試驗期開始第1天起，每周06:00對每頭仔豬進行空腹稱重并記錄，計算斷奶仔豬的RGR。RGR描述為初始權重和終末權重的自然對數之差除以權重之間的時間，而后將該比率乘以105，來規避縮放問題，計算公式[16]如下：

RGR=105×(lnBW2-lnBW1)/t。

式中：BW1為初始體重；BW2為終末體重；t為時間間隔。

1.3.2 糞便代謝組學檢測

對第29天采集到的仔豬糞便，采用UHPLC-QTOF-MS/MS系統進行非靶代謝組學分析。樣品準備與儀器參數詳見文獻[17]。原始數據經標準化后，用SIMCA-P 13.0多維偏最小二乘判別分析(partial square-discriminate analysis，PLS-DA)進行分析。

1.3.3 糞便短鏈脂肪酸(SCFAs)濃度檢測

用GC-14B型氣相色譜儀(島津公司，日本)測定糞便SCFAs濃度，毛細管柱(No.34292-07B，Supelco公司，美國)：30.00 m×0.32 mm×0.25 μm，柱溫130 ℃，汽化室和檢測器溫度均為180 ℃，載氣為氮氣，壓力為60 kPa，氫氣壓力為50 kPa，氧氣壓力為50 kPa。樣品處理參照秦為琳[18]。

1.4 數據統計與分析

所有數據經Excel 2016進行初步整理后，用SPSS 25.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較檢驗。非靶代謝組學數據通過PLS-DA的變量投影重要性(variable important in projection，VIP)值與t檢驗的P值進行差異代謝產物篩選，其中，將VIP>1且P<0.10的代謝產物定義為差異代謝產物，將VIP>1且P<0.05的代謝產物定義為顯著差異代謝產物。代謝產物KEGG富集分析過程中，以差異代謝產物作為富集對象[19]，Fisher精確檢驗分析各個通路代謝產物富集度的顯著水平。相關性分析采用Pearson相關。P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢。

2 結果與分析

2.1 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬RGR的影響

由表1可知，第1周、第2周和第4周時，3組之間斷奶仔豬RGR無顯著差異(P>0.05)；但在第3周時，ANT組的斷奶仔豬RGR顯著高于CTR組(P<0.05)，SYN組與其他2組的斷奶仔豬RGR無顯著差異(P>0.05)。此外，3組斷奶仔豬RGR在第1～4周存在差異顯著趨勢(P=0.052)，ANT組和SYN組比CTR組斷奶仔豬RGR分別提高了7.08%和6.00%，ANT組比SYN組斷奶仔豬RGR提高了1.01%。

表1 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬RGR的影響

2.2 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便代謝組學的影響

2.2.1 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便代謝產物多變量分析

由圖1可知，在正離子或負離子模式下，ANT組與CTR組、ANT組與SYN組、SYN組與CTR組糞便代謝產物在組成上均出現明顯區分。

2.2.2 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便中差異代謝產物篩選

通過非靶代謝組學方法，所有仔豬糞便樣品正離子模式下共檢測到232種代謝產物，在負離子模式下共檢測到189種代謝產物。基于顯著差異代謝產物的篩選標準(VIP>1，P<0.05)，在ANT組和CTR組之間共檢測到9種顯著差異代謝產物(圖2-A)，其中ANT組有7種代謝產物(腺苷琥珀酸、L-哌啶甲酸、3-羥基苯乙酸、D-半乳糖醛酸、吡哆胺、苯甲酸和2-乙氧基乙醇)含量顯著高于CTR組(P<0.05)，2種代謝產物(核黃素和環己胺)含量顯著低于CTR組(P<0.05)。在SYN組和CTR組之間共檢測到19種顯著差異代謝產物(圖2-B)，其中SYN組有18種代謝產物(D-乳糖、蔗糖、纖維二糖、犬尿喹啉酸、16-羥基棕櫚酸、D-麥芽糖、5-羥基吲哚乙酸鹽、二甲基異咯嗪、甘露糖、黃尿酸、腺苷、N-乙酰甘露糖胺、L-哌啶甲酸、吡哆胺、煙酸、順-9-棕櫚酸、D-木糖和鄰磺酰苯酰胺)含量顯著高于CTR組(P<0.05)，1種代謝產物(二乙醇胺)含量顯著低于CTR組(P<0.05)。在SYN組與ANT組之間共檢測到11種顯著差異代謝產物(圖2-C)，其中SYN組有8種代謝產物[D-乳糖、環己胺、所有順式(6,9,12)-亞油酸、腺嘌呤、反異油酸、N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸、煙酸和亞油酸]含量顯著高于ANT組(P<0.05)，3種代謝產物(2-氧己二酸、D-半乳糖醛酸和5-氨基戊酸)含量顯著低于ANT組(P<0.05)。

圖A、圖C和圖E分別為正離子模式下ANT組與CTR組、SYN組與CTR組和SYN組與ANT組代謝產物聚類結果。圖B、圖D和圖F分別為負離子模式下ANT組與CTR組、SYN組與CTR組和SYN組與ANT組代謝產物聚類結果。CTR：對照組；ANT：抗生素組；SYN：合生素組。

圖A為ANT組與CTR組之間顯著差異代謝產物，圖B為SYN組與CTR組之間顯著差異代謝產物，圖C為SYN組與ANT組之間顯著差異代謝產物。CTR：對照組；ANT：抗生素組；SYN：合生素組。

2.2.3 斷奶仔豬糞便差異代謝產物KEGG通路富集分析

ANT組和CTR組之間的差異代謝產物共4條通路出現顯著富集(P<0.05)，分別是賴氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和維生素消化吸收通路(圖3-A)。在賴氨酸降解通路中，ANT組L-哌啶甲酸(P<0.05)、5-氨基戊酸(P>0.05)和戊二酸(P>0.05)含量高于CTR組，N6-乙酰-L-賴氨酸含量低于CTR組(P>0.05)；在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，ANT組5-氨基戊酸、肌酸酐、4-胍基丁酸含量高于CTR組(P>0.05)；在維生素消化吸收通路中，ANT組吡哆胺含量高于CTR組(P>0.05)，核黃素含量顯著低于CTR組(P<0.05)；在苯丙氨酸代謝通路中，ANT組3-羥基苯乙酸和苯甲酸含量顯著高于CTR組(P<0.05)。

SYN組和CTR組之間的差異代謝產物共7條通路出現顯著富集(P<0.05)，分別是色氨酸代謝、ABC轉運蛋白、碳水化合物消化吸收、味覺轉導、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝和賴氨酸降解通路(圖3-B)。在色氨酸代謝代謝通路中，SYN組5-羥基吲哚乙酸鹽(P<0.05)、黃尿酸(P<0.05)、犬尿喹啉酸(P>0.05)和2-氧己二酸(P>0.05)含量高于CTR組，色胺含量低于CTR組(P>0.05)；在ABC轉運蛋白通路中，SYN組D-乳糖、蔗糖、纖維二糖、D-麥芽糖、甘露糖和腺苷含量均顯著高于CTR組(P<0.05)；在碳水化合物消化吸收通路中，SYN組D-乳糖、蔗糖和D-麥芽糖含量均顯著高于CTR組(P<0.05)；在味覺傳導、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝通路中，SYN組蔗糖、D-麥芽糖、糖精、纖維二糖、D-乳糖、甘露糖含量均顯著高于CTR組(P<0.05)。在賴氨酸降解通路中，SYN組甘露糖(P<0.05)、L-哌啶甲酸(P<0.05)、2-氧己二酸(P>0.05)均高于CTR組。

SYN組和ANT組之間差異代謝產物共4條通路出現顯著富集(P<0.05)，分別是ABC轉運蛋白、不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝和賴氨酸降解通路(圖3-C)。在ABC轉運蛋白通路中，SYN組D-乳糖(P<0.05)和L-纈氨酸(P>0.05)含量高于ANT組，D-半乳糖醛酸含量顯著低于ANT組(P<0.05)；在不飽和脂肪酸生物合成通路中，SYN組所有順式(6,9,12)-亞油酸(P>0.05)、亞油酸(P<0.05)和二十二碳六烯酸(P<0.05)含量高于ANT組；在亞油酸代謝通路中，SYN組所有順式(6,9,12)-亞油酸(P>0.05)、亞油酸(P<0.05)和13-OxoODE(P<0.05)含量高于ANT組；在賴氨酸降解通路中，SYN組N6-乙酰-L-賴氨酸(P>0.05)和N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸(P<0.05)含量高于ANT組，SYN組2-氧己二酸(P<0.05)、L-哌啶甲酸(P>0.05)和5-氨基戊酸(P<0.05)含量低于ANT組。

圖A為ANT組與CTR組之間糞便KEGG顯著富集通路，圖B為SYN組與CTR組之間糞便KEGG顯著富集通路，圖C為SYN組與ANT組之間糞便KEGG顯著富集通路。CTR：對照組；ANT：抗生素組；SYN：合生素組。

2.3 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便SCFAs濃度和比例的影響

由表2可知，3組之間總SCFAs及乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度無顯著差異(P>0.05)；ANT組丙酸比例顯著高于SYN組(P<0.05)，CTR組丙酸比例與其他2組差異不顯著(P>0.05)。3組之間乙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸比例無顯著差異(P>0.05)

2.4 斷奶仔豬糞便代謝產物含量與RGR相關性分析

將顯著差異代謝產物含量、SCFAs濃度與1～4周RGR進行相關性分析，結果見表3。RGR與D-半乳糖醛酸和甘露糖含量呈顯著負相關(P<0.05)，相關系數分別為-0.53和-0.52；RGR與環己胺含量呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.49。

表2 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便SCFAs濃度和比例的影響

表3 斷奶仔豬糞便代謝產物含量與RGR相關性

3 討 論

3.1 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬RGR的影響

本試驗中，第3周時ANT組斷奶仔豬RGR顯著高于CTR組，而SYN組與其他2組差異不顯著；第1～4周3組之間斷奶仔豬RGR存在顯著趨勢，其中SYN組RGR比CTR組提高了6.00%，ANT組RGR比CTR組提高了7.08%。有研究表明，AGPs可以通過直接抑菌和抑制炎癥作用，促進動物生長[20]；這與本試驗中ANT組第3周結果類似。ANT組與CTR組第1～4周時RGR差異不顯著，這可能與微生物對四環素類抗生素高度耐藥有關[21]。乳果糖或凝結芽孢桿菌的促生長作用已在多項研究中被報道。Guerra-Ordaz等[8]研究發現，飼喂含10 g/kg乳果糖的飼糧能顯著提高斷奶仔豬平均日增重和料重比。王乙茹等[22]研究發現，飼糧中添加2×106CFU/g凝結芽孢桿菌能顯著提高育肥豬生長性能。雖然，本研究中乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬RGR無顯著差異，但前期研究數據顯示該合生素可降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高總能和粗脂肪表觀消化率，降低血清TBIL含量，對斷奶仔豬料重比有一定改善作用[14]。

3.2 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素對斷奶仔豬糞便代謝產物的影響

腸道作為乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素發揮其生物學作用的主要場所，了解腸道內代謝產物的變化對于解析乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素的潛在作用機制至關重要。對第29天斷奶仔豬糞便代謝組學分析顯示，與CTR組相比，ANT組中有9種代謝產物受到顯著影響，其中5種有機酸在ANT組均顯著升高。前期研究顯示，有機酸能夠調節腸道pH，對抑制病原微生物、預防感染有重要作用[23]。同樣，與CTR組相比，SYN組有19種代謝產物受到顯著影響；對上述有差異的代謝產物分析發現，L-哌啶甲酸和吡多胺為SYN組和ANT組共影響的代謝產物。L-哌啶甲酸參與賴氨酸降解途徑，而賴氨酸是豬的第一限制性氨基酸，除廣泛參與豬體內酶、激素合成和脂肪代謝外，還能增強宿主免疫[24]。L-哌啶甲酸含量在ANT組和SYN組的升高提示金霉素與乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素可能均促進斷奶仔豬對賴氨酸的利用。此外，與CTR組相比，SYN組和ANT組還顯著影響有機酸和胺類物質的含量，其中包括核黃素、煙酸和腺嘌呤；上述代謝產物廣泛參與機體能量和脂質代謝過程，是哺乳動物生長代謝不可或缺的營養物質[25]。雖然，SYN組和ANT組相比CTR組影響的具體代謝產物大部分不同，但是富集通路顯示：與CTR組相比，SYN組與ANT組均顯著影響了多條必需氨基酸代謝通路。除賴氨酸降解通路外，ANT組還顯著影響苯丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝通路；而SYN組顯著影響色氨酸代謝通路。這些必需氨基酸在體內承擔包含蛋白質和酶合成、能量代謝等重要生理功能[29]。上述結果說明，乳果糖-凝結芽孢乳桿菌合生素也能通過不同的代謝產物顯著影響與金霉素相似的代謝通路。

此外，值得關注的是SYN組還顯著提高了D-木糖、甘露糖、D-麥芽糖、纖維二糖、蔗糖和D-乳糖在內的6種代謝產物。糖類是哺乳動物尤其是幼齡動物優先利用的能量物質，這一結果提示合生素可能影響了斷奶仔豬對腸道能量的利用模式。乳果糖屬于能量物質的一種，雖不能被動物消化道酶分解，但卻可以被消化道中的微生物發酵產生SCFAs和乳酸[26]，間接為宿主供能。而凝結芽孢桿菌不僅能自身分泌多種消化酶(如α-淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶等)，還能提高宿主消化道淀粉酶、脂肪酶活性，從而優化飼糧的利用模式[11,27]。因此，我們推測前期乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高總能和粗脂肪表觀消化率的可能原因歸結于SYN組提高了斷奶仔豬對于能量的利用與吸收效率。

與ANT組相比，SYN組3種有機酸(如亞油酸)、D-乳糖、環己胺、煙酸、腺嘌呤和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸含量顯著提高；此外，SYN組5-氨基戊酸、D-半乳糖醛酸和2-氧己二酸顯著低于ANT組。亞油酸屬于不飽和脂肪酸的一種，是具有降膽固醇、降血壓和提高機體免疫等效果的必需脂肪酸[28]。與ANT組相比，SYN組可能改善了斷奶仔豬的脂質代謝，提示SYN組仔豬可能擁有更強的不飽和脂肪酸生物合成能力和亞油酸代謝能力，這與前期發現乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素顯著提高粗脂肪表觀消化率的結果相符合。富集通路分析表明，與ANT組相比，SYN組賴氨酸降解和ABC轉運蛋白途徑通路顯著改變，提示SYN組在氨基酸利用和營養物質轉運方面的影響優于ANT組，具體機制需進一步探究。

在上述代謝組學分析基礎上，我們還發現糞便中丙酸比例在SYN組和ANT組之間出現顯著差異。SCFAs組成與斷奶仔豬腸道菌群密不可分，而金霉素和合生素均具備調整腸道菌群的能力[30-32]。結合代謝組學部分結果，我們推測丙酸比例在SYN組和ANT組之間出差異可能與仔豬對飼糧營養利用模式的變化和菌群產SCFAs模式變化有關。相關性結果證實，D-半乳糖醛酸、環己胺和甘露糖含量與仔豬RGR呈顯著相關性；因此，上述代謝產物或許可作為評價斷奶仔豬RGR的生物標志物，并且它們對RGR的貢獻值得進一步探究。

4 結 論

① 乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素可通過賴氨酸降解、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖、碳水化合物消化吸收等代謝通路影響仔豬的生長和代謝。

② 與CTR組相比，乳果糖-凝結芽孢桿菌合生素不僅具有和金霉素相似的促生長效果，還能部分影響糞便中和金霉素相同的代謝產物和代謝通路。此外，乳果糖-凝結芽孢桿菌影響糞便中代謝產物的種類和代謝通路比金霉素更加廣泛。

③ 糞便代謝產物D-半乳糖醛酸、環己胺和甘露糖含量與仔豬RGR呈顯著相關。