魚類雷帕霉素靶蛋白信號通路生物學功能的研究進展

吳龍華 梁化亮 戈賢平, 任鳴春,*

(1.南京農業大學無錫漁業學院，無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，無錫 214081)

雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是一種高度保守的蛋白激酶，屬于磷酸肌醇相關激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs)家族成員[1]。TOR通常與其他蛋白相互作用，形成2個不同的蛋白復合物雷帕霉素靶蛋白復合體1(target of rapamycin complex 1，TORC1)和雷帕霉素靶蛋白復合體2(target of rapamycin complex 2，TORC2)，以調節下游效應因子[2]。TORC1由TOR、TOR調節相關蛋白Raptor和mLST8組成，除此之外，TORC1的激活還涉及一系列調節蛋白如Rag GTP酶(Rag GTPases)[3]。TORC1被認為是營養物質和營養相關信號對細胞生長和代謝的調控中心，它整合了包括生長因子、氨基酸和能量等在內的一系列上游信號[4]。同時，TOR在調節細胞生長和細胞周期中起中樞作用。它能夠通過激活下游真核起始因子4結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase1，S6K1)，進而調控細胞生長、增殖、凋亡和自噬。本文將對魚類TOR信號通路生物學功能的研究進展進行綜述，以期為進一步研究TOR信號通路在水產動物中的作用提供參考。

1 魚類TOR信號通路生物學功能

相比于哺乳動物，有關魚類中TOR生物學功能的研究較少，大多集中在對營養物質的代謝調控上，如蛋白質合成代謝、糖代謝、脂代謝等。研究表明，動物機體營養物質的代謝調控均是由TOR形成的復合體TORC1來參與的[5]。在免疫調控方面，Weichhart等[6]報道，TOR能夠通過調節核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活性進而調控機體免疫，相似的結果在草魚[7]中也有發現。此外，在哺乳動物中發現，TOR還可以通過調節食欲肽的表達進而調控攝食[8-9]。梁曉芳[10]據此對花鱸(Lateolabraxjaponicus)的攝食調控進行了研究，發現TOR通過調控S6K1啟動食欲肽的表達，最終調控花鱸的攝食。

1.1 攝食調控

機體能量狀態可由胃腸道、肝臟等外周組織器官所感應，下丘腦可以對這些傳遞至中樞神經系統的相關內分泌信號進行整合，通過神經信號來調控食欲相關因子，并進一步對攝食進行動態調節。下丘腦部分信號通路如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信號通路可以參與攝食調控[11-12]。

下丘腦作為能量代謝調控中心，是mTOR主要的表達場所。pmTOR是mTOR的磷酸化形式，主要定位于室旁核和弓狀核(arcuate nucleus，ARC)的神經元中。ARC中含有促食欲神經元神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)和刺鼠相關蛋白(agouti-related peptide，AgRP)以及厭食欲神經元黑素皮質素(proopiomelanocortin，POMC)和可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)。其中mTOR/S6K1-NPY是最直接的攝食調控信號通路。在大鼠中的研究表明，攝食后ARC神經元中mTOR活性升高，而饑餓時活性降低[11]。研究表明小鼠AgRP和NPY的表達均因NPY/AgRP神經元中mTORC1特異性受體AgRP-raptor基因的敲除有所降低，但這并未影響其攝食行為以及代謝平衡，這可能是由于mTORC1信號通路并非是調控攝食行為的必要途徑[13]。作為mTOR信號通路的下游效應器，S6K1同樣在中樞神經系統中廣泛表達，并參與能量平衡的調節。但Smith等[14]通過敲除POMC和AgRP中的S6K1發現小鼠的采食量并未發生改變。這可能表明S6K1缺失時可能有其他機制來彌補相關功能。目前，梁曉芳[10]已在花鱸的研究中明確了mTOR和S6K1的磷酸化對于魚類攝食調控的關鍵作用。

Cota等[11]研究表明，飼糧中的氨基酸對于攝食也有一定的影響，精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu)能夠激活下丘腦mTOR，進而降低NPY和AgRP的表達，抑制動物的攝食。胰島素可以激活mTOR調控攝食，這種調控主要是通過磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)來實現的。也有研究表明食物中蛋白質含量也可以促進mTOR的磷酸化[15]。研究發現AMPK能夠通過Raptor抑制mTOR的活性[16]。還可以通過結節性硬化復合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)調節mTOR的活性[17-18]。因此，在下丘腦中，AMPK可能通過調節mTOR的活性來調控攝食量。

除上述食欲調控因子以外，也有研究表明由肝臟分泌的成纖維細胞因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)在攝食調控中也發揮著重要的作用[19-20]。FGF21在肝臟、胰腺、白色脂肪和棕色脂肪等多組織中均有表達[21]。如圖1所示，mTOR可以通過一般性調控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2，GCN2)進一步調控FGF21，最終調控攝食量。

基于上述基因對攝食的調控作用，可應用于魚類促攝食調控添加劑，以此人為調控魚類攝食，從而提高飼料利用率，但其最適添加量還有待研究。

1.2 代謝調控

1.2.1 蛋白質合成代謝

蛋白質合成是生長反應過程的關鍵組成部分，其限速步驟是翻譯起始[22]。TORC1調控著整體的翻譯水平，通過其下游4E-BP1和S6K1的磷酸化調控蛋白質合成與代謝[23]。S6K1和4E-BP1的磷酸化均依賴于Raptor，且相比于S6K1，4E-BP1的磷酸化對Raptor的依賴性更強[24]。真核翻譯起始因子4E(eIF4E)可以被4E-BP1所抑制，通過兩者的結合可以抑制蛋白質翻譯[25]。mTOR磷酸化4E-BP1從而使其失去活性，并與eIF4E發生解離，進而4E-BP1對eIF4E起始翻譯的抑制作用降低，使eIF4E的表達增高，進一步促進了蛋白質的翻譯[26]。而p70S6K的磷酸化則直接促進翻譯的起始過程，主要通過被磷酸化的S6K1使核糖體蛋白S6的5個絲氨酸殘基發生磷酸化，增強含嘧啶基因mRNA的翻譯功能，從而調節蛋白質的合成[27]。

有研究表明，適量的精氨酸水平可以提高蛋白質含量，主要是由于精氨酸或其代謝產物(谷氨酰胺和一氧化氮)通過激活機體mTOR信號通路進而磷酸化S6K1和真核起始因子4結合蛋白(eukaryotic translation initiation factor 4E binding proteins，4E-BPs)，進一步激活啟動多肽合成，最終促進蛋白質的合成[28-29]。除了營養素的調控，在最近的研究中，Wu等[30]研究發現在適宜的鹽度下養殖吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚可以通過刺激TOR信號通路提高魚體的蛋白質合成。此研究可在吉富羅非魚幼魚的養殖生產中為其養殖鹽度的選擇提供理論指導，同時我國作為鹽堿地大國，這對于開發利用鹽堿水域開展水產養殖具有重要的現實意義。其他環境因子如溫度、pH等對蛋白質合成的影響也有部分研究，但對于環境影響蛋白質合成的具體機制還有待進一步研究。

AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶 adenosine monophosphate activated protein kinase；TORC2：雷帕霉素靶蛋白復合體2 target of rapamycin complex 2；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 phosphoenolpyruvate carboxykinase；G6P：葡萄糖6磷酸 glucose-6-phosphate；ACC：乙酰輔酶A羧酸酶 acetyl-CoA carboxylate；GK：葡萄糖激酶 glucose kinase；TSC2：結節性硬化復合物2 tuberous sclerosis complex 2；NPY：神經肽Y neuropeptide Y；AgRP：刺鼠相關蛋白 agouti-related peptide；POMC：厭食欲神經元黑素皮質素 proopiomelanocortin；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；Akt：磷酸化蛋白激酶 protein kinase B；GCN2：一般性調控阻遏蛋白激酶2 general control nonderepressible 2；eIF2α：真核起始因子2α eukaryotic initiation factor 2α；ATF4：轉錄激活子4 activating transcription factor 4；FGF21：成纖維細胞因子-21 fibroblast growth factor 21；PKB：蛋白激酶B protein kinase B；STAT3：信號傳導與轉錄激活因子3 signal transducer and activator of transcription 3；JAK2：酪氨酸激酶 Janus kinase；IRS：胰島素受體底物 insulin receptor substrate；S6K：核糖體蛋白S6激酶 ribosomal protein S6 kinase；4E-BP1：真核起始因子4結合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1；eIF4E：真核翻譯起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E；SREBP-1：固醇調節元件結合蛋白-1 sterol regulatory element binding protein-1；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptor γ；FAS：脂肪酸合成酶fatty acid synthase；NF-κB：核因子-κB nuclear factor-κB；IL-8：白細胞介素-8 interleukin-8；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；AA：氨基酸 amino acids；Nrf2：核因子相關因子2 nuclear related factor 2；Keap1：Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1 Kelch-like ECH-associated protein 1；ROS：活性氧 reactive oxygen species；Insulin receptor：胰島素受體；Leptin receptor:瘦素受體；Feeding control：飲食控制；Promote：促進；Inhibit：抑制。

1.2.2 脂代謝

組織中脂肪的形成過程中，mTOR起著至關重要的作用[31]。在體外，通過抑制mTOR的活性可以阻斷脂肪生成[32]，而mTOR的過度活化則會促進脂肪生成[33]。有研究報道激活mTOR可以抑制脂肪分解，同時刺激脂肪從頭合成并促進細胞內的脂肪儲存[34]。此外，mTOR下游的S6K1能夠通過調節轉錄因子的表達來調控脂肪形成[35]。

乙酰輔酶A羧酸酶(acetyl-CoA carboxylate，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)是機體調控脂肪沉積主要酶和因子[36]。PPARγ參與脂肪的合成，能夠激活脂肪細胞的分化并且促進脂肪酸在脂肪組織中沉積，同時還可以調控特殊脂肪基因的表達[37]。mTOR調控脂肪細胞的終末分化主要是通過控制調節因子PPARγ的翻譯來完成的[38]。除了通過激活脂肪生成因子直接促進脂肪組織擴張外，mTORC1還通過S6K1介導的胰島素信號傳導抑制脂肪組織中的胰島素抵抗[39]。

脂肪合成相關酶的表達受固醇調節元件結合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1)的影響，同時它還可以調控脂肪和膽固醇的穩態。TORC1上調磷酸戊糖途徑相關基因的轉錄以及脂肪和甾醇的合成主要是通過激活SREBP-1來間接完成的[40]。在其脂質合成作用的研究中發現，進食或胰島素刺激均能提高SREBP-1的活性[41-42]。除能獨立調控SREBP-1活性外，TORC1還可以與磷酸化蛋白激酶(protein kinase B，Akt)協同調節[43]。在脂肪細胞中，脂質合成基因碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)的表達會隨著TORC2活性的喪失而下降，進而引起脂質合成以及脂肪生成轉錄因子的減少[44-45]。有研究表明，TORC2也可以促進肝臟脂肪的合成，這表明TORC2在脂質合成中具有廣泛的作用[46]。

在斑馬魚(Brachydanioreriovar)中的研究表明，餐后TOR信號通路被激活，FAS和ACCα基因的表達顯著上調；同時，斑馬魚肝胰臟肉堿棕櫚酰基轉移酶1b(carnitine palmityl transferase 1b，CPT1b)的表達受到顯著抑制[47]。而在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腹腔注射雷帕霉素后，脂肪合成途徑相關酶基因的表達將顯著下調，這些研究進一步說明脂代謝過程受TOR的調控[48]。此外，黃皓琰[49]對N-氨甲酰谷氨酸(NCG)抑制細胞外信號調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)-mTOR-S6K1信號通路調節脂代謝來減少花鱸肝臟脂肪蓄積進而改善肝臟健康的分子機制進行了探索。上述脂代謝調控機制的研究結果將有助于魚類脂肪肝的調節。

1.2.3 糖代謝

mTOR的蛋白質復合物mTORC1通過調節眾多糖酵解基因的正向調節子缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的轉錄和翻譯過程，進而增加糖酵解過程[50-52]。一些研究表明，mTORC1通過調節PPARγ的共激活子PGC1α以及正向調節線粒體合成和氧化功能的轉錄因子Ying-Yang1(YY1)來增加線粒體的DNA含量以及一些氧化基因的表達[53]。此外，mTORC1還可以通過促進核受體共抑制子在核內的聚集來抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)的活性，進而抑制肝臟內酮體的生成[54]，并且研究表明該過程受S6K2的調節[55]。

胰島素抵抗是指靶組織對正常循環水平的反應性降低，導致葡萄糖耐受不良、肥胖、血脂異常等代謝綜合癥狀[56]。導致胰島素抵抗的因素眾多，如TOR的超活化[57]。同樣的，胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)/PI3K/Akt信號通路在胰島素抵抗中發揮重要作用[58]。IRS作為信使分子激活的信號受體，是胰島素作用的重要步驟[59]。糖代謝中利用糖的主要途徑是糖酵解，此途徑有2個重要的限速酶丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)和葡萄糖激酶(glucokinase，GK)[60]。通過提高胰島素信號通路中IRS、PI3K和Akt等核心基因表達，可以進一步提高GK基因的表達，從而促進糖酵解。如圖1所示，胰島素/胰島素樣生長因子、能量狀態(AMPK)和氨基酸等營養物質均能激活TOR，進而調控TOR的下游信號S6K1和4EBP，但是S6K1的過度表達會通過負反饋調節機制抑制胰島素信號通路中IRS1的活性，并進一步抑制PI3K和下游Akt的活性，促進糖異生核心基因葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphate，G6P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)的表達，從而形成一個“負反饋環”，并對機體葡萄糖轉運和代謝產生不利影響[61]，即胰島素抵抗。

在團頭魴(Megalobramaamblycephala)幼魚中的研究表明精氨酸過量時會導致S6K1的過表達，從而通過負反饋調控機制來抑制胰島素信號通路核心基因的表達，同時降低葡萄糖轉運體2(glucose transporter 2，GLUT2)和血清胰島素水平，提高糖異生核心基因(PEPCK和G6P)的表達，從而產生胰島素抵抗現象，導致血糖水平異常[62]。此外，TOR對葡萄糖轉運有著重要的影響，它能夠顯著抑制葡萄糖轉運子GLUT4的表達以及脂肪的糖攝取功能[63-64]。在虹鱒的肝細胞中也有研究表明，氨基酸單獨作用時可以調控糖代謝，但它的調控方式與TOR信號通路的作用模式不同，而氨基酸與胰島素共同發揮作用時，可以產生具有典型TOR信號通路的調控模式，包括脂肪合成以及糖酵解的增強[65-66]。在氨基酸中，亮氨酸調控TOR信號通路的作用比甲硫氨酸和賴氨酸更強，當它和胰島素共同作用時，可抑制G6P的表達近90%，提高脂肪酸合成酶基因表達4倍以上[67]。這表明胰島素與氨基酸之間存在協同作用。除此以外，微量元素如鎂等也可以影響魚類機體的糖代謝[68]，但與TOR之間的調控還有待研究。

1.3 免疫調控

mTOR信號通路的免疫調控主要是通過影響mRNA的穩定性，從而進一步影響T細胞中免疫因子的表達[69-70]。NF-κB的表達在機體免疫中起著非常重要的作用，mTOR是NF-κB的上游信號分子，可以負調控NF-κB信號通路[7]。通過雷帕霉素抑制mTOR后，NF-κB轉錄活性提高，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎癥因子的表達也因此上調，進而啟動免疫反應，同時抑制信號傳導降低抗炎癥因子白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的表達。IL-10和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是重要的抗炎癥因子，可以通過抑制促炎癥因子的生成進而降低炎癥反應對機體的損傷[71]。此外，還有研究發現NF-κB與病毒之間可能存在緊密復雜的關系[72]，其機制還需進一步研究。

有研究表明，飼料中精氨酸水平最佳時可以提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的免疫應答[73-74]。而飼料中氨基酸不平衡(缺乏或過量)時會降低營養物質利用率，對免疫器官和免疫應答產生直接的負面影響[75]。王標[76]研究表明，精氨酸可以通過上調TOR的表達來抑制NF-κB的轉錄活性，從而抑制炎癥因子的表達；同時，精氨酸還可以通過抑制NF-κB核轉位抑制促炎癥因子的表達，NF-κB抑制劑α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)作為NF-κB p65的一個特異性的抑制蛋白，可以與NF-κB結合抑制其核轉位，從而降低下游促炎癥因子的表達。

Liang等[77]對團頭魴幼魚腸道免疫的研究發現，飼料中最佳精氨酸水平時可以通過提高TOR的mRNA表達量進而提高腸道抗氧化能力和免疫功能，并在維持腸道健康方面發揮重要作用。

1.4 抗氧化調控

在機體正常生理代謝和發生免疫反應時，機體會產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS主要包括超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫(H2O2)和一氧化氮(NO)等。當機體內ROS含量過高而超出機體清除范圍時，會造成氧化應激，引起蛋白質氧化、脂質氧化、染色體斷裂以及DNA堿基損傷。由于養殖魚類的肌肉中含有大量的不飽和脂肪酸(約33%)，容易遭受氧化損傷[78]。為了抵御外界的氧化損傷和ROS的攻擊，細胞形成了一套包括抗氧化酶和非酶性抗氧化物在內的抗氧化防御系統[79]。

核因子相關因子2(nuclear related factor 2，Nrf2)是水產動物機體抗氧化調控的重要因子，可以調控抗氧化酶基因的表達。Liang等[66]研究表明，飼料中精氨酸水平最佳時可以通過激活團頭魴Nrf2信號通路提高抗氧化酶或非酶抗氧化物的活性，上調其在腸道中的基因轉錄。在正常情況下，Nrf2的核轉位被Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)所抑制，當Nrf2和Keap1分離后，Nrf2發生轉移與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)上的位點結合，從而啟動ARE調控抗氧化酶基因的表達，增加細胞對氧化應激的抵抗能力[80]。

在草魚的研究中發現苯丙氨酸可以通過上調TOR的表達進而提高Nrf2的基因表達量，并進一步上調抗氧化酶基因的表達[81]。在Liang等[82]的研究中也發現類似的結果，亮氨酸可以通過激活TOR提高Nrf2的表達，進而調節抗氧化酶基因的表達。Seiliez等[83]研究發現胰島素可以上調虹鱒TOR基因的表達量，Nuttall等[84]研究發現苯丙氨酸(Phe)可以提高人類血清中胰島素水平，由此推測苯丙氨酸上調Nrf2的mRNA表達量可能與其調節TOR信號通路有關。在哺乳動物上的研究發現，上調TOR及其下游靶蛋白S6K1基因的表達能夠顯著提高Nrf2的表達[85]。王標[76]在草魚(Ctenopharyngodonidella)的研究中發現精氨酸可以通過上調TOR和S6K1的表達，進而上調Nrf2的表達。由此可以看出，上調抗氧化酶基因的表達主要是通過TOR進行調控的。

2 小結與展望

營養素、氨基酸以及激素等均可引起信號通路應答，從而間接調節蛋白質合成代謝、糖與脂代謝、攝食與免疫及抗氧化等過程，目前在哺乳動物中有關上述調控機制已有較深入的研究，但在水產動物中相關研究尚淺，且各營養素與TOR之間的聯系也需進一步探索，如已有研究發現硫辛酸可影響草魚脂代謝[86]，桑葉黃酮可影響吉富羅非魚肌肉抗氧化性能[87]，但如何通過TOR信號通路介導還不清晰。這些機制的探索將對提升水產動物的品質提供一定的理論依據。尤其對于養殖魚類攝食的調控，盡管TOR信號通路與攝食調控機制在魚類中已有部分研究，但關于FGF21等諸多食欲調節因子在魚類營養中的報道較少，且它們與TOR的調節機制也有待深入研究。此外，我們還可以探索氨基酸、營養物質以及激素在攝食調控方面的最佳需要量，以便應用于水產飼料添加劑，人為調控水產動物的攝食，提高飼料利用率。

目前，關于環境鹽度、溫度等對于TOR信號通路調節的分子機制研究較少，Wu等[30]研究發現，8‰鹽度養殖環境下吉富羅非魚幼魚的生長及蛋白質合成均高于淡水中，且在淡水和半咸水中吉富羅非魚幼魚的營養代謝也不同。但到目前為止，鹽度是如何調節TOR信號通路并進一步調控生長、免疫以及糖與脂代謝的還有待研究，是否像調控4E-BP1和S6K1一樣通過鹽度的變化使得胰島素和生長激素發生變化，再由PI3K-AKT-TOR來實現對生長、營養代謝的調控？鹽度升高時，生長會通過上述途徑受到抑制，那對于等滲點時生長的促進作用又是如何實現的？相同的問題在溫度對TOR的調節中也有待深入研究。解決這些問題后，我們可以在實際生產中人為地改變養殖環境，如改變養殖水體鹽度、利用儀器加熱等，使得養殖魚類的生長潛能得到更好地發揮。目前，羅非魚已普遍采取半咸水養殖，但在其他魚類中的應用還有待探索。總之，隨著TOR信號通路各種調節機制的深入研究，并應用于養殖生產中，其養殖效益也將有所提高。