珠芽黃魔芋組織培養與快繁技術研究

楊寶明，蘇 艷，李永平，楊超振，黃玉玲，李迅東，尹可鎖，王麗花，張藝萍

（1.云南省農業科學院農業環境資源研究所 云南省農業跨境有害生物綠色防控重點實驗室，云南昆明 650205；2.云南省農業科學院花卉研究所 農業農村部花卉產品質量監督檢驗測試中心（昆明）國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南昆明 650205；3.云南省農業科學院熱區生態農業研究所，云南元謀 651300）

珠芽黃魔芋是20 世紀90年代在東南亞等周邊國家熱帶森林中野生混合珠芽魔芋（Amorphophal?lus bulbifer）群體中發現并引種馴化栽培的一個魔芋新品種[1-4]。珠芽黃魔芋適種范圍廣，可與其他高桿作物間種；耐高溫和高濕，適于熱帶和亞熱帶地區種植，生長速度快、產量高、品質好且抗病性強。目前，其在云南德宏傣族景頗族自治州、西雙版納傣族自治州、臨滄市和普洱市等地的種植規模不斷增加[5-9]，并有推廣種植的趨勢[10]。隨著珠芽黃魔芋種植面積不斷擴大，用種需求不斷增加，種芋供給成為制約珠芽黃魔芋產業發展的瓶頸。傳統的塊莖切塊繁殖方法增殖速度慢、繁殖系數低、塊莖用量大，實際生產中還會傳播病害[11-13]。應用植物組織培養技術，開展珠芽黃魔芋組培快繁技術研究，建立無性快繁體系，在短時間內提供大量優質種芋，是緩解種芋供給問題的關鍵。有關珠芽魔芋組培技術的研究已有較多報導[13-16]，但珠芽黃魔芋該方面的研究較少，主要以葉柄為外植體[17]。珠芽黃魔芋屬于三倍體，有一定的特殊性，在其離體培養中存在外植體滅菌不徹底、污染率高、前期培養污染嚴重和無菌繁殖體系建立困難等問題，嚴重制約珠芽黃魔芋種苗的規模化生產。本研究以珠芽黃魔芋地下塊莖為外植體，開展外植體滅菌、愈傷組織誘導、不定芽增殖及生根壯苗試驗，篩選最佳組培快繁方法，以實用、高效和穩定的方法實現珠芽黃魔芋植株再生。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在云南省西雙版納傣族自治州農業科學研究所試驗田（100°77'E，22°00'N），選擇生長健壯、長勢良好且無病蟲害的珠芽黃魔芋地下塊莖為外植體，塊莖表面無蟲眼和病斑。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理

用自來水將塊莖表面泥土沖洗干凈，并用洗衣粉刷洗表面，再用自來水沖洗20～30 min。

1.2.2 外植體滅菌

在無菌工作臺上，用手術刀將塊莖切成2 cm×2 cm×2 cm 左右的小塊，用濃度為75%的酒精溶液浸泡30 s 后，分別按A1、A2、A3和A4四種方法進行滅菌處理（表1）。用無菌濾紙吸干表面水分，切除四周褐化組織。將滅菌后的外植體切成1 cm×1 cm×1 cm 左右小塊，接種至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培養基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復。培養5 天后，每3 天觀察污染情況1次，30天計算污染率及褐化率。

表1 滅菌方法Tab.1 Sterilization methods

1.2.3 培養條件

基本培養基（MS）為蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH值為5.8～6.0。培養溫度為（25±2）℃，光照時間為每天12 h，光照強度為1 600～2 000 lx。

1.2.4 愈傷組織誘導培養

愈傷組織誘導培養基為B1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B2：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B3：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B4：MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；B5：MS + 6-BA 1.5 mg/L +NAA0.5 mg/L；B6：MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5mg/L。

將經0.3%害剋溶液滅菌40 min 和0.1% HgCl2溶液滅菌5 min 處理后的外植體切成1 cm × 1 cm ×1 cm 左右小塊，分別接種至愈傷組織誘導培養基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復。培養5 天后，每3 天觀察生長情況1 次，30 天統計出愈塊數并計算愈傷組織誘導率。

1.2.5 不定芽增殖培養

不定芽增殖培養基為C1:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C2：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C3：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C4：MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；C5：MS + TDZ 0.05 mg/L +NAA 0.2 mg/L；C6：MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C7：MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

將培養得到的愈傷組織切成0.5 cm × 0.5 cm ×0.5 cm 左右小塊，接種至不定芽增殖培養基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復。培養30 天計算不定芽增殖系數。

1.2.6 生根壯苗培養

生根壯苗培養基為D1：MS+NAA 0.3 mg/L；D2：MS+NAA 0.4 mg/L；D3：MS+NAA 0.5 mg/L；D4：MS+IBA 0.5 mg/L；D5：MS+IBA 0.8 mg/L。

將增殖培養得到的高度為3～4 cm 的小苗從基部分割成單株，接種至生根壯苗培養基中，每處理接種5瓶，每瓶接種10株，3次重復。培養30天統計根數、測量株高并計算生根率。

1.3 數據處理

采用SPSS 統計分析軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 滅菌處理的滅菌效果

不同滅菌處理的外植體接種后，3～4 天開始陸續發生污染，20 天左右污染趨于穩定。不同滅菌處理的污染率差異顯著（P<0.05）（表2）。4 種處理的污染率分別為73.3%、53.3%、26.7%和20.0%，隨著滅菌時間的延長而降低；褐化率分別為25%、28.5%、9.0%和8.3%。A4處理的污染率和褐化率最低，為較適合珠芽黃魔芋塊莖的滅菌處理。

表2 不同處理對外植體滅菌效果的影響Tab.2 Effects of different treatments on sterilization of explants

2.2 不同處理對愈傷組織誘導的影響

無菌外植體在B1～B6培養基中培養12～18 天，基部開始膨大，25 天左右切口處開始產生愈傷組織，35 天左右愈傷組織形成瘤狀突起。各培養基的愈傷誘導率均差異極顯著（P<0.01）；隨著6-BA 和NAA 濃度的增加，愈傷誘導率增加，外植體膨大啟動時間縮短（表3）。6種培養基中，B6的愈傷誘導率最高（93.0%）、外植體膨大啟動時間最短（12 天），為愈傷組織誘導最佳培養基。

表3 不同處理對愈傷組織誘導的影響Tab.3 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同處理對不定芽增殖的影響

在C1～C7不定芽分化增殖培養基中培養35～40天，可獲得葉柄高度0～6.1 cm 的小苗。7種培養基均能誘導不定芽分化，平均增殖系數和不定芽的葉柄長均差異極顯著（P＜0.01）（表4）。TDZ 促進不定芽分化的作用大于6-BA，添加TDZ 的培養基最高增殖系數可達9.73，但存在葉柄短、葉片小、芽點多和芽密集等問題，當使用濃度高于0.20 mg/L時，會出現不定芽畸形、鱗片肥大和扭曲及無葉片等情況。從總體結果來看，6-BA 更適合不定芽增殖；NAA 濃度相同時，隨著6-BA 濃度的增加，增殖系數先增后降；6-BA 濃度為2.5 mg/L 時，增殖系數最大（8.67）。誘導不定芽增殖的最佳培養基為C3，其次為C2。

表4 不同處理對不定芽增殖的影響Tab.4 Effects of different treatments on adventitious bud proliferation

2.4 不同處理對不定芽生根的影響

各培養基均能誘導不定芽生根，生根率和平均根數均差異極顯著（P< 0.01）（表5）。添加NAA 的培養基生根較快，接種20 天左右開始生根，根系多且粗壯；添加IBA 的培養基生根較慢，接種23 天左右開始生根，根系較少。D3處理的生根效果最好，生根率最高（92.0%），生根時間最短（20 天），平均根數最多（7.23），為最佳生根培養基。

表5 不同處理對不定芽生根的影響Tab.5 Effects of different treatments on adventitious bud rooting

3 討論與結論

在組織培養中，外植體的滅菌效果直接影響無性繁殖，也是組培成敗的關鍵因素之一。外植體滅菌既要考慮滅菌效果，又要兼顧外植體的損傷程度及其再生能力，應選用適宜的滅菌方法以達到降低污染率、減小外植體損傷的目標。本研究結果顯示，單獨使用HgCl2溶液，滅菌效果不佳，隨滅菌時間的延長，褐化率升高；0.3%害剋溶液與0.1%HgCl2溶液配合使用縮短了HgCl2的使用時間，降低了外植體褐化率，污染率明顯低于單獨使用HgCl2溶液的處理。0.3%害剋溶液滅菌40 min 和0.1% HgCl2溶液滅菌5 min為珠芽黃魔芋塊莖的最佳滅菌方法。

激素的種類、濃度和配比也是影響組培的關鍵因素。在珠芽黃魔芋愈傷組織誘導中，增加6-BA和NAA 濃度，可促進愈傷組織形成，提高愈傷誘導率，愈傷組織形成早，生長快，最佳培養基為MS +6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L。在珠芽黃魔芋增殖培養中，NAA 濃度相同時，TDZ 對不定芽增殖的促進作用大于6-BA，但存在不定芽多、芽密集、植株矮和葉柄短等問題，不利于生根壯苗。6-BA 濃度為1.5～2.5 mg/L 時有利于不定芽增殖，芽叢粗壯且整齊；當6-BA 濃度為3.0 mg/L 時，不定芽增殖率降低，說明6-BA 濃度過高或過低均不利于不定芽的形成；最佳增殖培養基為MS + 6-BA 2.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。在生根培養中，NAA促進生根的效果明顯好于IBA，最佳生根培養基為MS+NAA 0.5 mg/L。該技術已在種苗生產上應用，基本解決了外植體滅菌不徹底、污染率高、褐化率高和前期培養污染嚴重等問題，增加了增殖系數，對種苗生產和相關研究有參考及指導意義。