產油皮狀絲孢酵母突變株的轉錄組分析

許鵬飛, 呂育財,2, 任立偉,2，ZHANG Yaoping, 龔大春,2

(1.三峽大學 生物與制藥學院 中國輕工業功能酵母重點實驗室，湖北 宜昌 443002; 2.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002; 3. DOE-Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) University of Wisconsin-Madison, Madison WI 53706,USA)

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)是一種可以利用葡萄糖、木糖等碳源在胞內積累油脂的產油微生物[1-2]，積累的油脂主要成分為甘油三酯(TAG)，其成分與棕櫚油、菜油相似，為C16和C18脂肪酸，可以作為生物柴油的原料[3]。由于微生物油脂產量不高，使得菌種選育成為微生物油脂研究的熱點。劉憲夫[4]利用乙基甲烷磺酸(EMS)誘變小球藻，使油脂產量提高了9.03%；郝冉等[5]利用紫外照射和氮離子注入技術處理深黃被孢霉，使γ-亞麻酸產量提高了60.27%。與傳統的紫外和化學誘變技術相比，常壓室溫等離子體(ARTP)作為一種新型的誘變手段被廣泛應用于菌種選育[6-8]，劉冬等[9]通過ARTP誘變紅酵母，油脂產量由1.22 g/L提高到3.96 g/L；Cao等[10]利用ARTP誘變小球藻，誘變菌株的油脂產量提高了16.85%。以上誘變方法都是非理性的研究，要想對產油微生物進行定向的育種還需了解產油途徑中關鍵基因及代謝途徑。

轉錄組測序是一種可以了解特定細胞體內RNA總和的技術，可以用來研究基因的轉錄情況和代謝調控規律，利用轉錄組分析可以探索突變菌株的基因差異表達情況及產油過程中起關鍵作用的酶[11-12]。

本研究以皮狀絲孢酵母為研究對象，利用ARTP對其進行誘變處理，篩選得到油脂高產菌株，再利用轉錄組測序技術研究高產菌株和原始菌株的轉錄組表達情況，篩選油脂積累的差異表達基因和差異表達酶，以期深入了解微生物油脂積累的基因表達和代謝調控，為進一步的菌株分子改造提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用皮狀絲孢酵母Trichosporoncuraneum2.571(WT)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；突變株A1由ARTP誘變篩選獲得[13]，保存于中國典型微生物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2018318。

1.2 ARTP誘變

取對數生長期的皮狀絲孢酵母(WT)，先經ARTP誘變處理，然后涂布到芝麻酚抗性平板上培養，挑選生長旺盛的菌落進行孔板培養，再利用尼羅紅熒光染色，選取高熒光強度的菌株，進行搖瓶發酵。

1.3 發酵培養過程相關指標的檢測

將兩菌株分別接種到搖瓶中培養，每天取樣檢測殘糖、生物量和油脂產量。

殘糖的含量：利用二硝基水楊酸(DNS)法[13]檢測培養基中的殘糖。

生物量的測定：取發酵液于烘干稱質量的離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液后加適量去離子水重懸，離心去上清液后放入100 ℃烘箱中，烘干至恒質量，計算生物量。

油脂產量的測定：將烘干的菌體1 g加入8 mL 8 moL/L的鹽酸，搖勻后室溫靜置1 h，再沸水浴10 min，冷卻后再沸水浴5 min。待溫度下降后，加入氯仿和甲醇溶液進行多次萃取，將收集到的氯仿層蒸發除去氯仿，得到微生物油脂，再計算油脂的產量。

1.4 轉錄組測序及分析

1.4.1 樣品準備

將WT和A1菌株劃線到YPD平板培養基上培養2 d，挑取單菌落接種到種子液培養18 h后進行發酵培養，培養至第9 天時取樣，用于轉錄組測序。

1.4.2 總RNA提取和檢測

利用Total RNA Extractor (Trizol)試劑盒提取總RNA、Qubit2.0檢測RNA濃度、瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。

1.4.3 cDNA文庫構建和測序

使用VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行文庫構建，采用Illumina HiseqTM進行高通量測序，得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別分析轉化為原始測序序列。文庫構建及轉錄組測序工作均委托上海生工公司完成。

1.4.4 基因功能注釋、分類

通過NCBI的核酸序列數據庫(NT)、非冗余蛋白序列數據庫(NR)、基因直系同源關系注釋系統(KOG)、注釋的蛋白質序列數據庫(Swiss-Prot)、保守結構域數據庫(CDD)、基因本體論(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)來注釋樣品的基因[14]。

1.4.5 差異表達基因分析

先采用TMM對read count數據進行標準化處理，之后用DEGseq進行差異分析[15]。為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設為：q值<0.05 且差異倍數(|log2FoldChange|)>2，來比較誘變菌株和原始菌株間的差異表達基因。對得到的差異表達的基因功能進行GO富集和KEGG代謝通路富集，并挑選與脂肪酸積累相關的候選基因。

1.4.6 差異表達基因RT-PCR驗證

挑選與油脂合成相關的上調基因，使用 Premier 5.0軟件設計合適引物，利用UNIQ-10 柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒提取酵母總RNA，進行反轉錄。再通過StepOne Plus型熒光定量PCR儀擴增相應基因。以actin為內參基因，計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 誘變結果

ARTP誘變儀通過高純He產生活性粒子來作用于微生物，使微生物的基因和細胞膜發生改變，從而影響微生物的代謝過程。通過ARTP誘變處理皮狀絲孢酵母并通過高通量篩選，從誘變庫中篩選得到一株較原始菌株有較大提高的誘變菌株A1，結果如圖1所示。由圖1可知：與原始菌株相比，菌株A1的生物量、油脂產量分別提高了41.7%、103.1%，油脂含量從39.3%提高到56.5%，誘變效果顯著。可見ARTP產生的活性粒子，能有效作用于酵母細胞基因，從而篩選出高產的突變菌株。

圖1 原始菌株(WT)與突變菌株(A1)油脂產量對比

2.2 發酵培養

兩菌株的搖瓶發酵結果如圖2所示。由圖2可知：當底物葡萄糖為70 g/L時，菌株WT對葡萄糖的利用率遠不如菌株A1，發酵72 h后菌株WT對葡萄糖的利用速率變得緩慢，而菌株A1一直處于快速消耗葡萄糖的狀態，直至葡萄糖耗盡。由于可以攝取更多的底物，所以菌株A1的生物量和油脂產量均比菌株WT的有了很大提高。

圖2 原始菌株(WT)與誘變菌株(A1)搖瓶發酵曲線

2.3 測序結果和質量評估

對原始菌和誘變菌進行Illumina測序，然后將得到的原始數據進行過濾，除去含有帶接頭的和低質量的序列，結果見表1。由表1可知：最終原始菌和誘變菌的總讀數分別為4 402萬和4 807萬，就總讀數而言，誘變菌株比原始菌多出了400萬的讀取數量；兩株菌的Q30百分比分別為95.76%和95.59%；GC含量分別為62.01%和62.98%。由此可見，測序質量較高，能滿足相應要求。

表1 WT和A1基因測序數據

2.4 基因功能注釋

將轉錄本總共得到的基因與9個數據庫進行比對，有79.13 %的基因至少被一個數據庫所注釋。在NR數據庫中，大多數注釋序列與Trichosporonoleaginosus和Yarrowialipolytica相近，相似序列分別有8 700、3 526個(圖3)。可見，經過誘變之后菌株的部分基因發生了改變，使其能夠大量積累胞內油脂。

圖3 同源物種分類

2.5 差異基因分析

2.5.1 差異基因篩選

對轉錄組進行比較，初步將定義差異倍數為2倍以上并且q值≤0.005的基因，篩選為顯著差異表達基因，結果如表2所示。由表2可知：菌株A1與WT相比，兩個樣品出現差異表達基因共1 185個，其中，上調表達 767個、下調418個，上調的基因數明顯高于下調基因數。變化為2<差異倍數<4的基因為694個，占58.57 %，差異倍數變化為4～6的基因占17.13 %，差異倍數變化為6～8和16～18的基因都占8%以上。

表2 顯著性差異基因表達上下調數量

2.5.2 差異基因GO富集分析

對兩個樣品的顯著差異基因進行GO富集分析，可以把差異基因分類到分子功能、細胞組分、生物過程3個方面。本次研究通過對差異表達基因進行GO分析，得到了差異基因GO富集圖，結果見圖4。

圖4 差異表達基因的GO功能富集圖

由圖4可知：在挑選的富集最顯著的37個GO term中，在生物學過程分類時細胞過程(cellular process)顯著性基因數目最多，高達938個，其次為代謝過程(metabolic process)和單組織過程(single-organism process)；在細胞組分中細胞(cell)、細胞部分(cell part)的差異基因數達到1 150個，其次為細胞器(organelle)和膜部分(membrane part)；在分子功能中主要差異基因富集在催化活性(catalytic activity)和結合分子(binding)兩個類別中。從GO富集情況可以看出誘變菌株A1的細胞部分與原始菌株有較大差異，從而使菌體的生長和細胞膜的通透性發生變化，進而影響菌體的催化活性，最后使菌體的代謝過程出現差異，使誘變菌株A1能更多地積累油脂。

2.5.3 差異基因KEEG富集分析

對差異基因進行KEEG富集分析可以更系統地了解差異基因產物的代謝途徑和差異基因產物的功能。圖5為差異基因的代謝通路富集情況，縱軸表示的是各通路(pathway)的信息，橫軸(rich factor)表示該通路中的差異基因數與注釋到該通路中的總基因數之比。q值的大小用點的顏色來表示，q值越小則顏色越接近紅色，每個功能下包含的差異基因的多少用點的大小來表示。當rich factor值越大，q值顏色越接近紅色，表示富集越明顯。

圖5 差異表達基因KEGG代謝通路富集

由圖5可知：兩個樣品的差異基因KEGG代謝通路中顯著富集的通路有酵母細胞周期(cell cycle-yeast)、酵母MAPK信號通路(MAPK signaling pathway-yeast)、基因復制(DNA replication)、真核生物中的核糖體生物發生(ribosome biogenesis in eukaryotes)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化(pentose and glucuronate interconversions)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)等。

在代謝途徑中，尋找與脂肪酸合成相關的上調差異基因，可為后期的分子育種和定點改造提供基礎。從差異表達的基因中選取了3個基因，結果如表3所示。

表3 顯著上調基因的功能和代謝通路

由表3可知：這些基因涉及三羧酸循環、糖酵解、甘油磷脂代謝、類固醇生物合成等；其中，在三羧酸循環中檸檬酸合成酶(CIS)相關基因過表達，CIS加強了乙酰-CoA和草酰乙酸的縮合反應[16]，使產物檸檬酸的生成量增加[17]，檸檬酸通過穿梭作用可以到達細胞質中，作為脂肪酸合成的原料。胡利華等[18]將CIS的基因導入秈稻中，秈稻可以耐受低磷土壤并分泌大量檸檬酸。童晉[19]研究油菜中的CIS對脂肪酸合成的影響時發現，在植物的脂肪酸合成過程中，CIS是重要的調控酶，該酶表達量的上升會造成脂肪酸合成量的增加，這與本研究的結果相一致。

在糖酵解途徑中，3-磷酸甘油醛脫氫酶可以催化3-磷酸甘油醛氧化(脫氫)和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是糖代謝的中心環節，對糖代謝起著重要的作用[20-21]，因為產生的1，3-二磷酸甘油酸是糖酵解途徑中第一個產生ATP分子的底物，產生的ATP可以為后續反應提供能量，Vigeolas等[22]在油菜中表達了酵母菌中3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，甘油-3-磷酸脫氫酶活性提高1倍，最終的脂肪含量增加40%。甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)是磷脂代謝中的關鍵酶，可將甘油磷酸二酯水解為3-磷酸甘油和一些肌醇、膽堿等營養物質[23-24]。這將有利于酵母的生長和發育。

2.5.4 差異表達基因的逆轉錄PCR(RT-PCR)驗證

對上述的3個相關基因進行RT-PCR驗證，差異基因和內參基因的引物設計及序列如表4所示。RT-PCR的結果如圖6所示。由圖6可知：由于TRINITY_DN8489_c0_g1基因的差異性較小，經RT-PCR驗證時出現較小差異，其他2個表達差異較大的基因，與反轉錄測序結果(表4)中基因的變化趨勢基本一致。

表4 RT-PCR驗證基因及其引物

圖6 差異表達基因的RT-PCR 驗證結果

3 結論

經ARTP誘變處理的突變菌，在生物量、油脂產量分別提高了41.7%、103.1%，油脂含量達到了56.5%，通過對高產菌株進行轉錄組測序，能進一步幫助我們了解菌株的基因表達差異及代謝差異。

對菌株WT與A1進行轉錄組測序過濾后，篩選差異倍數為2倍以上并且q值≤0.001的基因為顯著差異表達基因，菌株A1與WT相比，兩個樣品出現差異表達基因共1 185個，其中，上調表達 767個、下調418個，上調的基因數明顯高于下調基因數。對差異基因進行GO富集分析，發現差異基因主要富集在細胞過程、代謝過程、細胞部分、催化活性；對差異基因進行KEGG富集分析，發現差異基因主要富集在酵母細胞周期、基因復制、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、糖酵解/糖異生等。在代謝途徑中選取了3個與脂肪酸合成相關的上調基因及對應的酶，RT-PCR驗證發現這些酶參與微生物的能量循環和甘油磷脂代謝，可為脂肪酸的合成提供足夠的底物(檸檬酸、草酰乙酸)和能量以及營養物質，這將有助于油脂酵母積累更多的油脂。以上發現可為后續的油脂酵母分子育種和定點改造提供理論基礎。