少根根霉及其產物的研究進展

朱洪霞，劉 歡，張亞鵬，劉 鑫，范天一，王 芳，鄧 利

(北京化工大學 生命科學與技術學院 北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029)

少根根霉(Rhizopusarrhizus)是一種常見的絲狀真菌，廣泛存在于植物、動物及土壤中。少根根霉的研究始于20世紀，因其具有產物種類多、營養要求簡單、環境適應能力強、生長迅速等優點而被應用于多種領域。少根根霉應用最廣泛的異名是米根霉，可分為原變種、東京變種和德氏變種這3個變種[1]，其發酵產物包括有機酸及酶類，可作為重要的原料和高效催化劑應用于化工、醫藥及食品領域。同時，少根根霉菌絲體在作為酶固定化載體和有害物質吸附介質方面有較大的利用價值。

近年來，富馬酸的市場需求量逐漸增大，尤其是在食品和醫藥領域：富馬酸可作為酸味劑用于食品加工，富馬酸及其聚合物作為醫用材料的前體在醫藥領域也逐漸得到應用[2]。少根根霉是發酵產富馬酸的主要微生物，其酶系豐富，可產脂肪酶、淀粉酶等，具有廣泛的底物適應性。目前，發酵用于廉價可再生原料綠色生制造平臺化合物(如富馬酸、脂肪酶、淀粉酶、纖溶酶及乙醇等)的底物有葡萄糖、甘油、木糖、木質纖維素及餐廚廢棄物等[3-5]。由于添加不同底物，少根根霉生長狀態各有不同，其偏重產物也有所差別，所以本文對少根根霉生產不同產物的研究進行總結，并對其產物及菌絲體的利用進行介紹。

1 少根根霉產富馬酸

富馬酸是一種天然存在的有機酸，是三羧酸循環的一個中間體，也是美國能源部優先發展的十二種平臺化合物之一[6]。富馬酸因分子量小、緩沖能力強，可作為檸檬酸的替代品[7]，它不僅可作為酸味劑、防腐劑添加到食品中，還可作為多種藥物合成的前體[8-9]。早在1911年，Ehrlich就發現根霉菌具有生產富馬酸的能力，隨后Foster等[10]從8個不同種屬的微生物中篩選了41株菌，經鑒定后發現根霉菌的富馬酸產量最高。目前報道的富馬酸生產有化學合成法和微生物發酵法[11]，相比于化學合成法，微生物發酵法以其原料可再生、綠色環保等優點成為常用的工業化生產富馬酸的方法[12]，少根根霉因富馬酸產量高也成為發酵產富馬酸的優勢菌。

1.1 少根根霉產富馬酸的代謝機制

富馬酸在根霉體內的積累機制一直受到廣泛關注，目前公認的是Osmani等[13]提出的“胞液途徑”學說。Wright等[14]利用同位素標記法建立了根霉菌以葡萄糖為碳源的代謝模型，利用14C同位素標記葡萄糖，分析根霉菌代謝過程中的各種產物，證實了富馬酸是由胞液途徑轉化而來。甘油、木糖、淀粉等碳源經糖酵解等途徑轉化為丙酮酸，其中一部分流向線粒體，經氧化后進入三羧酸循環，為細胞生長提供能量，另一部分留在胞質中轉化為草酰乙酸，進一步經蘋果酸生成富馬酸，同時，丙酮酸也可在胞質中轉化為乙醇、乙酸和乳酸等其他產物，代謝途徑如圖1所示。

(1)—己糖激酶；(2)—葡萄糖磷酸異構酶；(3)—6-磷酸果糖激酶；(4)—醛縮酶；(5)—磷酸丙糖異構酶；(6)—磷酸甘油醛脫氫酶；(7)—磷酸甘油酸激酶；(8)—磷酸甘油酸變位酶；(9)—烯醇化酶；(10)—丙酮酸激酶；(11)—丙酮酸脫氫酶系；NAD—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；ADP—腺嘌呤核苷二磷酸；ATP—腺嘌呤核苷三磷酸；TCA—三羧酸循環

1.2 少根根霉產富馬酸發酵工藝研究

少根根霉已被證明是較理想的富馬酸生產菌株，并且眾多研究者對其發酵生產過程進行了探究和優化。在傳統的發酵過程中，多以葡萄糖為發酵原料，成本較高，有與人爭糧、與糧爭地的缺點[15]，因此，研究少根根霉對廉價碳源的高效利用對節約資源、降低生產成本有重要意義。從目前的研究結果來看，木糖、木薯粉、粗甘油等可在一定程度上替代葡萄糖作為少根根霉發酵生產富馬酸的碳源，研究人員通過探究不通碳源條件下少根根霉發酵產富馬酸的狀況來擴大少根根霉的碳源適用范圍，相關研究結果見表1[16-24]。由表1可知：少根根霉利用餐廚垃圾及水解液等原料發酵生產富馬酸的產量還較低，但我國目前存在大量的此類資源，因此對這些資源的高效利用還需進一步研究，若能提高對餐廚垃圾及工業副產物水解物的利用率，這在資源的再利用方面具有重要的意義。有關少根根霉利用不同原料發酵產富馬酸的情況如表1所示。

表1 少根根霉發酵不同碳源產富馬酸

另外，為了改良發酵工藝，李鑫等[25]研究了外源添加蘋果酸、草酰乙酸、丙酮酸對米根霉產富馬酸的影響，結果發現添加適當濃度的中間代謝物均會使富馬酸產量提高。基于少根根霉具有良好附著性的特點,Gu等[26]和Liu等[27]采用網布固定菌絲體進行發酵，發酵時間與游離態細胞發酵時間相比縮短83.3%，而富馬酸產量卻十分接近(分別為32.03和31.23 g/L)，這不僅改進了富馬酸的發酵方式，也節約了發酵時間。Liu等[28]采用類似的方法進行放大研究，在5 L攪拌式反應器中以絲瓜瓤作為載體固定少根根霉生產富馬酸，其產量達46.8 g/L，此方法不僅解決了菌絲不耐剪切的問題，也為富馬酸的工業生產提供了一種新的工藝。

2 少根根霉產脂肪酶

脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)又稱三酰基甘油酰基水解酶，可將甘油三酯水解為脂肪酸、甘油二酯、單甘酯和甘油。脂肪酶的獲取途徑主要有提取法、微生物發酵法等，其中微生物發酵法因環境污染小且生產成本較低成為目前生產脂肪酶的主要方法。脂肪酶因其高度的選擇性和專一性而廣泛應用于食品加工[29-30]、藥物合成[31]以及生物柴油轉化[32]等領域。

2.1 少根根霉產脂肪酶菌種選育

真菌來源的脂肪酶由于其高度的穩定性而被廣泛研究，且部分已被制成商品化酶制劑[33]。根霉所產的脂肪酶優先水解飽和脂肪酸鏈，具有較強的sn-1,3位專一性，應用價值較高[34]。少根根霉是一種低等真菌，想對其進行定向的基因改造存在一定的困難，因此大部分研究仍通過誘變育種來實現高產脂肪酶菌株的選育。喬紅群等[35]利用紫外線與硫酸二乙酯復合的方式對一株根霉菌進行誘變，使其脂肪酶活提高52%。冀頤之等[36-37]分別采用原生質體激光誘變和低能N+注入技術對少根根霉進行誘變處理，得到的目的菌株酶活提高了165%。

2.2 少根根霉產脂肪酶發酵工藝研究

隨著研究的進一步深入，研究人員對少根根霉產脂肪酶的發酵工藝進行了探究，以期得到少根根霉產酶的最佳條件，結合發酵條件優化，部分少根根霉菌發酵產脂肪酶情況如表2所示。

表2 少根根霉發酵產脂肪酶工藝研究

因為少根根霉菌絲發達，易纏繞成團，所以這會影響發酵結果，表2的研究證明了固定化菌體發酵能較好地解決少根根霉發酵過程中菌體纏繞和傳質限制的問題，可有效促進菌體的生長和脂肪酶的合成。尹春華等[40]率先采用珍珠巖和聚氨酯泡沫作為根霉發酵產脂肪酶的固定化載體，使酶活提高了8倍。以此為基礎，Yang等[43]以聚氨酯泡沫為固定化載體對固定化菌絲體分批次發酵進行了研究，結果發現，固定化菌絲體可在搖瓶中完成9批次產酶過程，在5 L發酵罐中成功實現6批次的產酶發酵，此法既提高了對菌絲體的利用效率又增加了脂肪酶的積累量，在未來的工業化生產中具有較大的開發潛力。

3 少根根霉產其他產物

除富馬酸、脂肪酶外，少根根霉還可積累多種有機酸類、醇類及酶等產物，如乳酸、乙醇、纖溶酶及淀粉酶等[45-49]，其相關研究報道結果總結見表3。

表3 少根根霉產其他產物

因為少根根霉具有較廣泛的產物種類，所以在利用少根根霉發酵產L-乳酸的研究中，乳酸產量和生產強度多在60～120 g/L和0.7～2.5 g/(L·h)，Fu等[50]利用一步發酵法將少根根霉的生長和產酸在同一培養基中進行，使其持續發酵直至耗糖結束，這與傳統發酵法相比，菌體密度有所升高且乳酸產量也顯著提高。另外，少根根霉是傳統發酵中的可食用菌株，也是經FDA認證的安全菌，其糖化能力強，可將淀粉近乎理論值地轉化為葡萄糖。同時，少根根霉是酒曲微生物的重要組成部分，具有較好的產乙醇能力，現根霉制曲已廣泛應用于白酒、黃酒等發酵產品的生產[49]。隨著人們對食品安全的逐步重視，少根根霉因其自身的安全性和可食用性在釀造行業具有良好的應用前景。

4 少根根霉菌絲體的綜合利用

少根根霉不僅能用于生產多種產品，而且其菌絲體也具有重要的應用價值。由于少根根霉菌絲體含有豐富的多糖類物質及蛋白質，經加工處理后通常可作為替代成分添加到飼料中[51]，用于畜禽的養殖。除此之外，少根根霉的菌絲體也可作為廢水中重金屬離子及放射性元素的吸附劑、酶的固定化載體，還有用作生物質保溫材料的潛力[52]。

原子能工業或其他工業產生的廢水中往往含有放射性元素或重金屬離子，為防止其對環境造成污染，需在排放前將其去除。少根根霉的菌絲體胞壁呈多層、微纖維結構，存在多個離子的吸附位點，且吸附能力強，可通過物理和化學吸附、靜電作用、離子交換和絡合等方式將重金屬離子吸附到細胞表面“富集”起來，以降低廢水中重金屬離子的濃度[53]。菌絲體的吸附能力除受菌體量以及離子半徑的影響外，受pH的影響較為明顯，在不同pH條件下，菌絲體對各類重金屬離子及放射性元素的吸附效率也會不同(表4)。在相同的pH條件下，菌絲體對不同物質的吸附率存在差異，可通過實驗優化，調節反應體系至最佳pH時，其吸附率可大大提高。

表4 少根根霉菌絲體對廢水中有害物質的吸附

少根根霉的菌絲體除用于吸附重金屬離子及放射性元素外，還可作為脂肪酶的固定化載體。在生物柴油生產過程中，脂肪酶存在反應速率低、應用成本高、易失活等問題，但是來自不同真菌的菌絲結合酶是自然固定且非常穩定的，所以以菌絲體作為酶固定化的天然載體被認為是一種廉價的替代方法，用于脂肪酶在生物柴油和其他領域中，具有較大的開發潛力[58]。田嬌嬌[59]以少根根霉菌絲體為載體，經吸附和包埋相結合的固定化方法制備了一種核殼結構固定化酶，研究結果表明以其作為載體制備的固定化酶具有較好的穩定性和較高的使用效率。另外，少根根霉菌絲體在生長過程中能相互交聯形成纖維網狀結構，且其幾丁質含量較高，具有較好的穩定性和阻燃性[60]，如將其與珍珠巖等其他材料復合，有用于制作生物質保溫材料的潛力。綜上，少根根霉菌絲體的應用不僅能實現對發酵廢棄物的有效利用，降低生產成本，也可減小環境壓力。隨著研究的進一步推進，少根根霉菌絲體在其他領域的應用也將逐步得到開發。

5 展望

少根根霉具有環境適應能力強、營養要求簡單、酶系豐富、可積累多種天然產物的優點，在食品、醫藥及化工等領域發揮越來越重要的作用，但目前仍然有幾個技術難點阻礙了其產業化應用。首先，少根根霉形態發育機制不明，缺乏遺傳操作工具，想要通過對菌株進行定向改造獲得高產菌還有很大的困難，若能應用新型誘變技術——常壓室溫等離子體誘變等技術建立菌種選育方法，結合基因工程及組學的分析手段解析少根根霉細胞內基因的表達過程，剖析影響基因表達及其關鍵酶活性的因素，可獲得穩定性好、活性高的少根根霉生產菌株。其次，少根根霉為無隔低等真核生物，其菌絲體不耐剪切，在發酵放大方面仍存在一定困難，若能將固定化技術應用到工業生產的發酵罐中，不僅能克服這一技術難點，還會在很大幾率上降低生產成本。最后，少根根霉發酵生產過程仍存在產率低、分離純化工藝繁瑣等問題，與傳統化學法相比仍缺乏競爭性，關于少根根霉發酵分離耦合的研究還需進一步推進，從而實現目標產物最大限度的積累，推動少根根霉發酵生產的產業化趨勢。