基于多指標成分含量測定的肺寧合劑與中藥配方顆粒比較

沈 申,嚴寶飛,陳亞運,戴仕林,劉圣金,朱星宇,劉 嘉,富瑩雪

(1.南京中醫藥大學附屬醫院 制劑部,江蘇 南京 210009;2.南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023;3.江蘇衛生健康職業學院 藥學院,江蘇 南京 211800)

肺寧合劑是江蘇省中醫院的特色醫院制劑,由麻黃、苦杏仁、甘草、前胡、桔梗、瓜蔞皮及枇杷葉合用,具有疏風達邪、宣肺化痰和降逆止咳之功效。全方宣中有降、散中寓清,俾宣降有致及溫潤有度,頗合肺臟之性；并且不偏寒熱,適應證較廣,主要用于急性支氣管炎、上呼吸道感染、慢性支氣管炎急性發作及感冒后咳嗽等[1-2]。自20世紀70年代投入使用以來,經臨床數以萬計的病例驗證,其治療效果滿意,每年可為數十萬病人解除病痛[3-5]。

中藥配方顆粒是一種新型的中藥飲片,主要由單味飲片經提取、濃縮、干燥及制粒加工而成,具有質量穩定、規范及攜帶方便和服用簡單等諸多優點,在中醫臨床上正逐漸成為傳統飲片的藥劑補充。但是,配方顆粒的服用方法為直接開水沖服,與傳統湯劑相比,缺少了組方藥物“共煎”的過程。因此,其與傳統飲片在化學成分、臨床功效方面的一致性等方面亟待深入研究[6-9]。

廣義的化學成分是中醫方劑發揮其功效的物質基礎[10],中藥化學成分種類、含量與中藥功效多樣性聯系緊密,本研究選擇肺寧合劑中的君藥(麻黃、苦杏仁和甘草)以及臣藥(前胡)中的麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種與其臨床功效密切相關的指標成分進行含量測定[11-14],從物質基礎角度直觀比較傳統飲片與配方顆粒之間的異同。中藥及其組方中化學成分可通過多種途徑,作用于多個靶點,影響多個生物學功能及通路參與疾病的治療[15],且中藥及其組方中化學成分的“量”與“效”關系密切[16],故本研究采用網絡藥理學的方法探討二者含量差異顯著的指標成分的作用途徑和通路,希望從分子機制水平闡述含量差異對肺寧合劑對相關疾病的治療影響,以期對中藥配方顆粒進一步研究與應用以及肺寧合劑質量標準的提升提供一定的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜系統,美國Waters公司;BT25S十萬分之一電子天平,德國Sartorius公司;As3120型超聲波清洗器,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Anke GL-16g2型離心機,上海安亭儀器廠;RE-201d型旋轉蒸發系統,上海保玲儀器設備廠。

1.2 藥材與試劑

1.2.1 藥材

對照品麻黃堿(批號:171237-201208)、偽麻黃堿(批號:171241-201007)，苦杏仁苷(批號:110820-201607)，甘草苷(批號:131704-201605)，甘草酸(批號:110731-201317)，白花前胡甲素(批號:112112-201203)，白花前胡乙素(批號:111904-201203),中國食品藥品檢定研究院,含量均大于98%,化學結構式見圖1。

圖1 7種指標成分的化學結構式

炙麻黃飲片(批號:1706144)，安徽協和成藥業飲片公司；甘草飲片(批號:1708142)、苦杏仁飲片(批號:1708146)、桔梗飲片(批號:1707136)、瓜蔞皮飲片(批號:1705089)、前胡飲片(批號:1706189)、炙枇杷葉飲片(批號:1701105)，安徽井泉中藥飲片有限公司;炙麻黃顆粒(批號:1707142)、甘草顆粒(批號:1710138)、苦杏仁顆粒(批號:1708145)、桔梗顆粒(批號:1801002)、瓜蔞皮顆粒(批號:18010371)、前胡顆粒(批號:1710145)、炙枇杷葉顆粒(批號:1707003),自制。以上7種中藥飲片均經南京中醫藥大學劉圣金教授鑒定,分別為草麻黃(EphedrasinicaStapf)的干燥草質莖,甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根和根莖,山杏(Prunusarmeniaca(L.)Lam.)的干燥成熟種子,桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq.))A.DC.的干燥根,栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的干燥成熟果皮,白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)的干燥根,枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)的干燥葉。

1.2.2 試劑

乙腈(C2H3N),美國TEDIA公司；H3PO4,美國ACS公司;H2O為超純水,蘇州Milli-Q純水機自制。

1.3 方法

1.3.1 肺寧合劑傳統飲片湯劑的制備

將一定量的炙麻黃飲片、甘草飲片、苦杏仁飲片、桔梗飲片、瓜蔞皮飲片、前胡飲片和炙枇杷葉飲片置于密閉容器中,加入8倍量H2O,靜置30 min后煎煮40 min,過濾,濾渣繼續用6～8倍H2O煎煮40 min,合并濾液,濃縮至250 mL,即得。

1.3.2 中藥配方顆粒湯劑的制備

精密稱取相當于肺寧合劑傳統飲片湯劑中各原藥材的中藥配方顆粒,適量混合后，加入一定量的沸水,攪拌溶解,冷卻至室溫,定容至250 mL,即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密吸取肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑各4 mL至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,超聲30 min,冷卻,補足甲醇至刻度,搖勻,離心10 min(取上清,13 000 r/min)后,過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

1.3.4 對照品溶液的制備

分別精密稱取麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素對照品適量,加甲醇制成分別含上述對照品446.5、365.1、1 231.8、550.2、682.2、53.5和43.2 μg/mL的混合對照品溶液,分別稀釋2、4、8、16和32倍備用。

1.3.5 色譜條件

色譜柱為Thermo-C18endcapped(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.1%(體積分數，下同)H3PO4-H2O-C2H3N(B),梯度洗脫(0～10 min,5%B;10～30 min,5% ～10%B;30～50 min,10% ～15%B;50～70 min,15% ～22%B;70～75 min,22% ～30%B;75～95 min,30%～60%B;95～105 min,60% ～80%B;105～115 min,80% ～95%B;115～120 min,95%～5%B),柱溫為30 ℃,檢測波長為210 nm,流速為0.8 mL/min,進樣量為10 μL。

1.3.6 線性關系的考察

準確移取1.3.4節中7種對照品制成的混合對照品溶液,按照1.3.5節中的色譜條件進樣,記錄7種指標成分色譜峰的峰面積。以標準品濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),得出線性關系。依據信噪比計算檢測限(LOD)、定量限(LOQ)。

1.3.7 精密度試驗

準確移取1.3.4節中7種對照品制成的混合對照品溶液,按照1.3.5節中的色譜條件進樣，1 d內連續進樣6次，在連續3 d內重復進樣6次,記錄7種指標成分色譜峰的峰面積,計算7種指標成分的相對標準偏差(RSD)。

1.3.8 穩定性試驗

準確量取肺寧合劑傳統飲片湯劑樣品6份,按照1.3.3節中的方法，制備供試品溶液,按照1.3.5節中的色譜條件，在0、3、6、9、12和24 h進樣,記錄7種指標成分色譜峰的峰面積,計算7種指標成分的RSD。

1.3.9 重復性試驗

準確量取肺寧合劑傳統飲片湯劑樣品6份,按照1.3.3節中的方法制備供試品溶液,按照1.3.5節中的色譜條件連續進樣,記錄7種指標成分色譜峰的峰面積,計算7種指標成分峰面積的RSD。

1.3.10 回收率試驗

采用加樣回收法(按體積比1∶1加入,下同),精密量取肺寧合劑傳統飲片湯劑2 mL,至10 mL量瓶中,精密加入各對照品適量,按照1.3.3節中的方法制備供試品溶液,平行制備6份。按照1.3.5節中的色譜條件連續進樣,計算7種成分的平均回收率和RSD。

1.3.11 樣品指標成分含量的測定

準確量取1.3.3節中制備的肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑供試品溶液,按照1.3.5節中的色譜條件進樣,每份樣品進樣3次，取平均值，記錄麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標成分的含量。

1.3.12 差異成分作用靶點的獲取

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以1.3.11節中得出的差異成分為關鍵詞檢索作用靶點。登錄蛋白質數據庫UniProt(http://www.uniprot.org/),設置物種為“人”的UniProt KB數據,利用perl語言工具(http://www.perl.org/)校正預測的靶點名稱。

1.3.13 差異成分作用靶點的生物功能注釋及通路分析

將1.3.11節獲取的作用靶點的編碼基因導入Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org/),以P<0.05進行基因本體論(GO)功能注釋及基因的基因組百科會書(KEGG)通路富集分析,得到差異成分作用靶點的主要生物功能和過程及其發揮中醫臨床功效可能性較大的通路。

2 結果與討論

為盡可能全面地反映肺寧合劑傳統飲片湯劑與中藥配方顆粒湯劑中的化學成分信息,本研究對流動相系統中H3PO4-C2H3N、甲酸水-C2H3N、H3PO4-甲醇和甲酸水-甲醇進行了比較,結果以H3PO4-C2H3N為流動相系統干擾小、色譜峰分離效果較好。本研究亦對H3PO4-H2O的體積比(0.05%、0.1%和0.2%)進行考察,結果表明：體積分數0.1%H3PO4-H2O能較好地改善峰形。因此,本研究確定以體積分數0.1%H3PO4-H2O-C2H3N為流動相系統。對洗脫程序進行了考察,發現7種指標成分可分為生物堿類、苷類、黃酮類、三萜類和香豆素類5類化合物,結構和類型差異明顯,本研究確定的梯度洗脫程序色譜信息豐富且指標成分均達到基線分離。對樣品進行紫外-可見波長(190～400 nm)掃描。結果顯示：麻黃堿、偽麻黃堿僅在210 nm有紫外吸收,此時苦杏仁苷亦有最大紫外吸收,甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素紫外吸收也較強。因此,本研究確定的檢測波長為210 nm。對柱溫(20、25、30和35 ℃)進行比較,結果顯示：當柱溫升高時,色譜峰的保留時間會發生前移,當柱溫達到35 ℃時,基線不能完全分離。因此,綜合考慮保留時間及分離度等因素,本研究確定以30 ℃為柱溫。

2.1 高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)分析結果

混合對照品溶液、肺寧合劑傳統飲片湯劑、中藥配方顆粒湯劑的高效液相色譜圖見圖2。由圖2可知：麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標成分的保留時間分別為16.2、18.3、33.6、57.9、87.1、103.7和109.4 min;肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑在相同保留時間基本均有共有峰,但共有峰峰面積存在差異,即肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑在化學組成上差異不大,但含量上存在差異。

圖2 混合對照品、肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的HPLC-UV色譜

2.2 線性關系的考察結果

麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標成分線性關系考察結果見表1。由表1可知：7種指標成分在各自線性范圍內線性關系良好,可用于準確定量。

表1 7種指標成分的線性關系

2.3 方法學的考察結果

麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標成分的精密度、穩定性、重復性和加樣回收率結果見表2。由表2可知：本研究建立的方法具有良好的精密度、穩定性、重復性和加樣回收率。

表2 7種成分精密度、穩定性、重復性及加樣回收率試驗結果(n=6)

2.4 樣品指標成分含量的測定結果

肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素成分含量見表3。由表3可知：肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中均含有麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素，但含量存在差異。肺寧合劑傳統飲片湯劑中的麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷含量顯著性大于中藥配方顆粒湯劑,而苦杏仁苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量在兩者間無顯著性差異。

表3 肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中7種成分含量的測定結果(n=3)

2.5 差異成分作用靶點的獲取結果

肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中的差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷在TCMSP數據庫對應的作用靶點為24個,結果見表4。由表4可知：差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過多種作用靶點造成肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效的差異。

表4 差異成分作用靶點

2.6 差異成分作用靶點的生物功能注釋及通路分析

本研究借助R語言,運用“clusterProfiler”程序包,利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG通路數據庫獲取富集分析結果。由GO功能分析獲得63個條目,其中具有顯著意義的有48個條目(P<0.01),采用P值和基因富集數量綜合過濾,對其進行排序,取排名前20的條目,結果見圖3。由圖3可知:差異成分作用靶點富集顯著的生物學功能主要為G蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合,提示差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過多種生物學途徑造成肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效差異。

圖3 差異成分作用靶點GO功能分析結果

KEGG通路富集分析共獲得9條通路,具有顯著意義的有2條通路(P<0.01),采用P值和基因富集數量綜合過濾,對其進行排序,結果見表5。由表5可知:差異成分作用靶點基因顯著富集在信號通路為cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路,提示差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路引起肺寧合劑傳統飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效差異。

表5 差異成分作用靶點KEGG通路富集分析結果

3 結論

采用的中藥配方顆粒的生產原料來源與實驗中采用的飲片藥材一致,可以消除不同批次、不同產地藥材之間的品質差異帶來的影響,保證實驗結果的科學性。

本研究建立的HPLC-UV法精密度高、重復性好,系統分析了江蘇省中醫院特色制劑肺寧合劑傳統飲片湯劑與中藥配方顆粒湯劑化學成分的相似性,首次同時對其中與肺寧合劑臨床功效密切相關的麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標成分進行定量分析,從功效物質基礎角度全面評價二者之間的異同,發現二者化學組成上差異不大,但含量存在差異,其中肺寧合劑傳統飲片湯劑中的麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷含量顯著性大于配方顆粒湯劑,3個差異成分可通過干預24個靶點、9條通路引起肺寧合劑傳統飲片湯劑和配方顆粒湯劑臨床療效的差異。說明用中藥配方顆粒代替傳統飲片生產的肺寧合劑的可行性還需要被進一步論證,提示未來將在中藥配方顆粒的提取工藝和質量標準上進行進一步的提升以及在傳統復方湯劑的化學成分、臨床功效方面的一致性上還需繼續進行深入的研究。