耐熱抗病辣椒種質“墨麗-M-Bs23/Me1R”的創制

李 寧 尹延旭 余楚英 高升華 王 飛* 焦春海 姚明華

（1.湖北省農業科學院經濟作物研究所/蔬菜種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室， 武漢430064； 2. 湖北省農業科學院， 武漢 430064）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國栽培面積最大的蔬菜作物，年種植面積約為213.33萬hm2（3 200萬畝），總產量6 399.4萬t，辣椒產業已成為我國最大的蔬菜產業。湖北省是我國辣椒主產區之一，受湖北氣候特點影響，辣椒生長過程中極易受高溫和多種病蟲害威脅，其中細菌性瘡痂病、根結線蟲病等就是主要發生的流行性病蟲害。

辣椒細菌性瘡痂病（Bacterial Spot Disease）由黃單胞桿菌屬細菌（Xanthomonas campestris pv vesicatori, Xcv）引起，是鄂西高山辣椒生產中最嚴重的病害之一，嚴重影響辣椒的產量和品質。應用辣椒瘡痂病抗源基因、培育抗病品種是解決瘡痂病危害最為有效的途徑。辣椒對瘡痂病菌的抗性為質量性狀，與瘡痂病菌的互作遵循“gene for gene”假說。前期研究中，已明確了湖北省辣椒瘡痂病菌優勢生理小種為P0，因此應用Bs2和Bs3抗源基因，轉育、聚合、創制抗性育種材料能夠有效克服瘡痂病的危害。

根結線蟲是危害辣椒生產的重要土傳蟲害，培育抗病品種是解決根結線蟲危害最為有效的途徑。目前至少有11個抗根結線蟲基因被鑒定，其中Me1、Me2、Me3、Me4、Me7和Mech1基因是耐熱的Me基因，Me1、Me3和Me7有廣譜抗性[1-2]。研究表明，Me1是一個抗性非常持久的基因，它不能夠被毒性或者非毒性線蟲小種侵染；利用22種番茄Mi基因的非毒性小種及毒性小種試驗也表明Me1抗所有毒性和非毒性小種[3-5]。因此，轉育和應用Me1抗性基因對辣椒抗根結線蟲育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒材料“墨麗-M-1”（原始編號：P5114）為湖北省農業科學院經濟作物研究所課題組選育的核心親本自交系，果實為長羊角椒，果面光亮，果皮呈墨綠色，中熟材料，耐熱，株型直立，綜合性狀優良；經接種鑒定抗根結線蟲，同時分子標記檢測攜帶Me1基因。

甜椒材料“ECW20R”和“ECW30R”為抗瘡痂病鑒別寄主，分別攜帶Bs2和Bs3抗性基因，是從甜椒材料“ECW”選育出的近等基因系材料，來源University of Florida，由Stall Robert 教授提供。

辣椒瘡痂病病原菌來源華中農業大學生命科學院，由王猛教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間雜交、回交及配組試驗 自2014年春季開始材料創制工作。首先，“ECW20R”和“ECW30R”進行雜交，獲得同時攜帶Bs2和Bs3抗源基因的材料“ECW2030R”；再以“墨麗-M-1”為母本，以“ECW2030R”為父本，獲得F1；以“墨麗-M-1”為輪回親本，利用與Bs2和Bs3基因連鎖的基因標記進行回交后代的選擇，同時進行園藝性狀的選擇和人工接種鑒定。經過連續回交5代和自交3代，育成兼抗瘡痂病和根結線蟲的辣椒種質。2018年春季進行雜交配組試驗，篩選出配合力優良的雜交組合進行品比試驗。

1.2.2 辣椒抗瘡痂病和根結線蟲的分子標記輔助選擇 與辣椒抗根結線蟲Me1基因連鎖標記參照Berthou等[6]和Wang 等[7]描述。與辣椒抗瘡痂病Bs2基因連鎖基因標記參照Truong等[8]，與Bs3基因連鎖基因標記由本課題開發[9]。具體分子標記序列信息見表1描述。

表1 本試驗所用的分子標記序列信息

基因組DNA提取參照Porebski等[10]的方法略有改進。PCR擴增體系參照Berthou 等[6]、Wang 等[7]和Truong 等[8]文中描述，PCR產物檢測參照李寧等[11]描述，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3 辣椒抗瘡痂病抗性接種鑒定 辣椒抗瘡痂病接種方法參照李寧等[12]描述，分別采用注射接種和噴霧接種兩種方法。將保存的瘡痂病病原菌菌株在YDC平板培養基上劃線，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，挑選單菌落，用無菌水分別配制成濃度約為108cfu/mL的菌懸液。接種苗齡為4 片真葉，接種濃度為2×108cfu/mL。

注射接種法，在苗子長至四葉一心時，注射接種上述配制好的菌懸液，對照植株的葉片用滅菌水，葉片上接種2～3 mm大小的斑，然后放置在溫室（28 ℃）中，觀察注射區域是否有壞死斑出現，并進行統計，能夠很快鑒定材料抗/感。

噴霧接種法，在苗子長至四葉一心時，噴霧接種后置于人工氣候室內，溫度設定為28 ℃，相對濕度 85%，光照 14 h/d（70 μmol/m2/s），15 d后觀察單株抗性水平進行分級，然后計算病情指數。

瘡痂病病情分級及病情指數計算參照湖北省地方標準《辣椒瘡痂病抗性鑒定技術規程》（DB42/T 1698—2021）描述[13]。

1.2.4 辣椒耐熱性鑒定 辣椒耐熱性鑒定方法參照鞏振輝等[14]和余楚英[15]描述的鑒定方法，略有改動。幼苗長6～7片真葉時，選取辣椒從上往下第4片功能葉，打葉盤至裝有30 mL蒸餾水中，一式兩份分別放置25 ℃和40 ℃的人工氣候箱中，連續光照處理24 h。辣椒離體葉圓片耐熱性鑒定分級標準參照鞏振輝等[14]描述。

2 結果與分析

2.1 種質創新過程

湖北省辣椒瘡痂病菌優勢生理小種為P0，根據Stall 等[16]的鑒別寄主表，Bs2和Bs3抗源基因均對P0生理小種表現為抗性，能夠用于抗瘡痂病育種實踐中。以攜帶抗原基因的鑒別寄主材料“ECW20R”和“ECW30R”進行雜交，聚合獲得同時攜帶Bs2和Bs3抗源基因的材料“ECW2030R”的F1雜交種（圖1）。“ECW2030R-F1”可以看作“ECW”的近等基因系材料，與“ECW”具有相同的園藝學特征，果形方燈籠形，但后代在Bs2和Bs3位點呈現Bs2Bs2、Bs2Bs3和Bs3Bs3的分離。

圖1 墨麗-M-Bs23/Me1R創制系譜圖

“墨麗-M-1”為“鄂椒墨麗”的母本，是本課題組選育的核心育種材料，攜帶抗根結線蟲Me1基因。以“墨麗-M-1”為母本，“ECW2030R”為父本，獲得聚合Bs2和Bs3基因的三交種F1代，果形為雙親本中間型，呈長燈籠形；以“墨麗-M-1”為輪回親本，利用與Me1基因（圖2）和Bs2、Bs3（圖3、圖4）基因連鎖的基因標記進行回交后代的選擇，同時進行園藝性狀的選擇，重點選擇果形。在BC1F1～BC4F1代中果形分離明顯，但隨著回交代數的增加，果形逐漸偏向輪回親本“墨麗-M-1”；在BC5F1代果形大體穩定，與“墨麗-M-1”基本一致。進一步自交純化2代，果形與“墨麗-M-1”一致；同時進行Bs2和Bs3基因分子標記篩選，在候選的單株中均能同時檢測到Bs2和Bs3基因，也可證明材料已基本趨于穩定，將該材料命名為“墨麗-MBs23/Me1R”。同時，對BC5F3各株系進行抗瘡痂病人工接種鑒定，其抗性鑒定結果與分子鑒定的結果相吻合。種質轉育創制的過程具體見圖1。

圖2 引物SCAR_CD的檢測結果

圖3 引物14F/R的檢測結果

圖4 引物Bs3F/R的檢測結果

2.2 “墨麗-M-Bs23/Me1R”的植物學特征及配合力

創制的材料“墨麗-M-Bs23/Me1R”果實果形與“墨麗-M-1”一致，同時BC5F3各株系整齊度好，花期和開花節位一致（圖5）。

圖5 墨麗-M-Bs23/Me1R的植株特征

分別利用“墨麗-M-Bs23/Me1R”和“墨麗-M-1”為母本，與“鄂椒墨麗”的父本“THI-P-22-1”進行雜交，獲得F1代。對“墨麗-M-Bs23/Me1R×THI-P-22-1”和 “墨麗-M-1×THI-P-22-1”的雜交組合的果實商品性、單果質量、產量、首花節位進行比較，“墨麗-M-Bs23/Me1R×THI-P-22-1”和 “墨麗-M-1×THI-P-22-1”間的差異不顯著。

表2 轉育抗病材料與回交親本配組比較

2.3 “墨麗-M-Bs23/Me1R”及其輪回親本抗性鑒定

在“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的幼苗長至四葉一心時，注射接種配制好的瘡痂病菌懸液，對照植株的葉片用滅菌水，葉片上接種2～3mm大小的斑，然后放置在溫室（28 ℃）中，接種24 h后，“墨麗-M-Bs23/Me1R”的注射區域有壞死斑出現，表現出抗病，而“墨麗-M-1”則不能誘導HR反應。15 d后統計病情指數，“墨麗-M-1”病情指數為59.23(A)，“墨麗-M-Bs23/Me1R”的病情指數為7.31(B)。誘導壞死反應及病情指數的鑒定結果均顯示，“墨麗-M-Bs23/Me1R”對辣椒瘡痂病菌表現為抗性，這也與分子檢測的結果一致。

在“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的幼苗長至六葉一心時，選取辣椒從上往下第4片功能葉，打葉盤至裝有 30 mL蒸餾水中，一式兩份分別放置25℃和40℃的人工氣候箱中處理。結果顯示，“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”均呈現葉圓片邊緣輕度失綠的癥狀，統計計算熱害指數，分別為11.32(a)和13.14(a)，二者差異不顯著（圖 6）。

圖6 “墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的耐熱性鑒定

3 結論

（1）根據Bs3基因啟動子區在抗病材料ECW30R與感病材料ECW的序列差異，開發了Indel標記引物Bs3F/R；該標記對抗感瘡痂病材料的鑒定結果與人工接種鑒定結果完全一致，能夠準確鑒定出Bs3基因。

（2）利用與辣椒抗瘡痂病Bs2、Bs3基因和抗根結線蟲Me1基因緊密連鎖或共分離的分子標記，能夠準確快速的從回交群體中篩選出目標性狀材料，極大的提高育種的準確率、預見性和效率。

（3）創制出耐熱兼瘡痂病和根結線蟲雙抗的辣椒種質“墨麗-M-Bs23/Me1R”，具有輪回親本“墨麗-M-1”的特征，配合力高，商品性優。