蘿卜硫素對L- NAME誘導的人胎盤滋養細胞株HTR- 8/SV- neo氧化應激與凋亡的影響及其可能機制初探

程麗，陳梅

(潛江市婦幼保健計劃生育服務中心，湖北 潛江 433100)

妊娠期高血壓疾病(hypertension disorder complicating pregnancy, HDCP)是孕婦所特有而常見疾病之一，其臨床特點主要包括高血壓、蛋白尿、水腫、昏迷以及心腎功能衰竭，嚴重時甚至引發死亡[1- 3]。HDCP病因和發病機制復雜，胎盤是母體與胎兒間進行物質交換的器官，胎盤滋養細胞功能異常會導致胎盤形成受阻，引發妊娠相關疾病[4- 5]。蘿卜硫素(sulforaphane)是一種具有抗氧化損傷作用的活性物質，主要成分為異硫氰酸酯[6]，能夠預防各種類型的癌癥，降低心血管疾病發生風險，并具有抗氧化、抗炎與免疫調節等作用[7- 9]。然而蘿卜硫素在妊娠相關疾病，尤其是HDCP中的作用至今未見報道。已知N- 硝基- L- 精氨酸甲酯(L- nitro- arginine methyl ester，L- NAME) 作為一氧化氮合酶抑制劑可干預人胎盤滋養細胞，從而能夠模擬HDCP微環境進行相關體外研究。本研究通過L- NAME干預HTR- 8/SVneo細胞模擬 HDCP微環境，觀察蘿卜硫素對HDCP胎盤滋養細胞氧化應激損傷、炎癥反應及細胞凋亡的影響，初步探究其作用的信號通路，以期為HDCP的研究與診治提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人胎盤滋養細胞株HTR- 8/SV- neo購自美國ATCC細胞庫，蘿卜硫素(純度≥98%)購自杭州林格貝公司(批號20171106- 2)，c- Jun氨基末端激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)信號通路阻斷劑SB203580和L- NAME購自Sigma公司，胎牛血清、青霉素、鏈霉素及DMEM/F12培養基購自美國Gibco公司，細胞計數試劑盒- 8(CCK- 8)和Annexin V- FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京全式金生物科技公司，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自北京默沙克公司，腫瘤壞死因子- α(TNF- α)、白細胞介素(IL)- 1β、IL- 6酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物有限公司，原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒、細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自上海碧云天生物技術有限公司，磷酸化JNK(p- JNK)抗體、JNK抗體、磷酸化p38 MAPK(p- p38 MAPK)抗體、p38 MAPK抗體購自美國Abcam公司，甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞培養與處理

HTR- 8/SV- neo細胞株復蘇后，添加含10%胎牛血清、青霉素(100 U·ml-1)/鏈霉素(100 μg·ml-1)雙抗液的DMEM/F12 培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養基培養，每 2 d換液 1 次，待細胞融合度達到80%～90%時進行傳代，本實驗使用第3～5代細胞。

1.3 分組與藥物處理

將處于對數生長期的HTR- 8/SV- neo細胞調整濃度為4×104個·ml-1，取100 μl接種到96 孔板。實驗分組包括對照組、模型組、3個劑量(10、20、40 μmol·L-1)蘿卜硫素組和阻斷劑組。細胞過夜培養后，對照組細胞正常培養，不同劑量蘿卜硫素組細胞分別使用終濃度為10、20、40 μmol·L-1的蘿卜硫素培養72 h，阻斷劑組細胞使用終濃度為15 μmol·L-1的SB203580培養24 h，接著，除對照組外的其余各組細胞均繼續使用100 μmol·L-1的L- NAME干預48 h，收集細胞。

1.4 CCK- 8實驗

將HTR- 8/SV- neo細胞按照1.3所述分組與處理后，每孔加入10 μl CCK- 8試劑，混合均勻后置于細胞培養箱中反應 1 h，上酶標儀測定 490 nm 處的吸光度值，實驗重復3 次。

1.5 Annexin V- FITC/PI雙染法

將HTR- 8/SV- neo細胞按照1.3所述分組與處理后，使用胰蛋白酶消化，收集細胞，以PBS洗滌2次，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞后，參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，依次加入5 μl 的Annexin V- FITC和PI試劑，混勻后在室溫下避光反應15 min，然后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

1.6 MDA、SOD 和 GSH水平檢測

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細胞，裂解細胞獲取上清液，采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量，化學比色法檢測SOD、GSH活性，具體按試劑盒說明書操作。

1.7 ELISA法

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細胞，裂解細胞并提取上清液，使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測上清液中TNF- α、IL- 1β、IL- 6含量，操作嚴格按試劑盒說明書進行，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.8 TUNEL染色

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細胞，PBS洗滌后使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，含0.3% Triton X- 100的PBS重懸細胞，室溫孵育5 min，加入TUNEL檢測液，充分混勻，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌細胞后進行涂片，通過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

1.9 蛋白質印跡法

收集處理后的各組HTR- 8/SV- neo細胞，加入細胞裂解液置于冰上進行裂解，以10 000×g 離心20 min后取上清，BCA法對蛋白含量定量。每孔加入20 μg總蛋白樣品進行10%SDS- PAGE 凝膠電泳，將分離蛋白電轉印至PVDF膜，室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入稀釋的抗體p- JNK(1∶1 000)、JNK抗體(1∶1 000)、p- p38MAPK抗體(1∶1 000)、p38MAPK抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日，TBST液洗膜后加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)，室溫孵育 2 h 后滴加ECL超敏發光液顯色，凝膠成像儀中曝光成像，BandScan 5.0軟件分析各條帶灰度值，計算各條帶的相對灰度值。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 各組HTR- 8/SV- neo細胞存活率比較

HTR- 8/SV- neo細胞存活率檢測結果顯示，6組間細胞存活率差異有統計學意義。與對照組相比，模型組細胞存活率顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素作用的細胞存活率顯著升高(P<0.05)，而經15 μmol·L-1SB203580作用的細胞存活率也顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組HTR- 8/SV- neo細胞存活率比較

2.2 各組HTR- 8/SV- neo細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細胞凋亡率差異有統計學意義。與對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，經10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)。見圖1。

a 與對照組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

TUNEL染色結果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細胞TUNEL陽性率差異有統計學意義。對照組細胞凋亡數較少，模型組細胞TUNEL染色增加，細胞凋亡較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細胞TUNEL染色減少，細胞凋亡數顯著減少(P<0.05)。見圖2。

a 與對照組比較，P<0.05； b與模型組比較，P<0.05

2.3 各組HTR- 8/SV- neo細胞MDA含量及SOD、GSH活性比較

HTR- 8/SV- neo細胞中MDA含量及SOD、GSH活性檢測結果顯示，各組間細胞中同一指標差異均有統計學意義。與對照組比較，模型組細胞中MDA含量顯著增加，SOD、GSH活性顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細胞中MDA含量顯著減少，而SOD、GSH活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組HTR- 8/SV- neo細胞中MDA含量和SOD、GSH活性

2.4 各組HTR- 8/SV- neo細胞TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量比較

ELISA檢測結果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量差異均有統計學意義。模型組細胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素和15 μmol·L-1SB203580作用的細胞，TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量顯著減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組HTR- 8/SV- neo細胞TNF- α、IL- 1β和IL- 6水平

2.5 各組HTR- 8/SV- neo細胞JNK/p38MAPK信號通路相關蛋白表達比較

蛋白質印跡法檢測結果顯示，6組間HTR- 8/SV- neo細胞中各蛋白表達水平差異均有統計學意義。與對照組比較，模型組細胞中 p- JNK與p- p38MAPK蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素組作用的細胞中p- JNK蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，20、40 μmol·L-1蘿卜硫素組作用的細胞中p- p38MAPK蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，15 μmol·L-1SB203580作用細胞后也顯著抑制了p- JNK與p- p38MAPK蛋白表達(P<0.05)。見圖3與表4。

表4 各組HTR- 8/SV- neo細胞p- JNK、JNK、p- p38MAPK及p38MAPK蛋白表達水平

圖3 蛋白質印跡法檢測p- JNK、JNK、p- p38MAPK及p38MAPK蛋白表達 A.對照組； B.模型組； C.10 μmol·L-1蘿卜硫素組； D.20 μmol·L-1蘿卜硫素組； E.40 μmol·L-1蘿卜硫素組； F.阻斷劑組

3 討 論

HDCP占妊娠者的大約10%，是目前婦產科處理最棘手的問題。在過去的幾十年，HDCP的發病率呈增加趨勢，主要歸因于產婦肥胖、高齡和合并癥等因素。HDCP使得產婦患腦血管疾病、胎兒生長受限、早產以及產婦、圍產兒死亡的風險大大增加。HDCP的發病機制源于胎盤異常，其中心環節是滋養細胞功能異常所致的胎盤功能障礙[3]。然而胎盤的正常生長和發育是成功植入和妊娠的關鍵，并且需要調節胎盤滋養細胞的侵襲能力及其在蛻膜中的分化和增殖[10]。此外，在妊娠期間胎盤功能障礙、先兆子癇和宮內生長受限是導致許多圍生兒死亡的主要原因。因此，胎盤滋養細胞的功能在HDCP發病中起著關鍵作用。本研究結果顯示，經L- NAME干預誘導的HTR- 8/SV- neo細胞存活率明顯下降，細胞凋亡增加，說明L- NAME干預導致了HTR- 8/SV- neo細胞異常生物學行為的發生。

蘿卜硫素能通過調節相關酶來保護細胞免受DNA損傷，改變與細胞周期、凋亡及血管生成有關蛋白質的表達及活性，這在癌癥的治療中起著至關重要的作用[11]。此外，還有研究表明蘿卜硫素能夠影響核因子E2相關因子2(NRF2)的活化以及對核因子- κB(NF- κB)信號傳導途徑發揮間接抑制作用，從而抑制組織中的炎癥反應[12]。在本研究中，先經10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素處理的HTR- 8/SV- neo細胞再經L- NAME干預，提高了細胞存活率，并有效抑制了細胞的凋亡，由此推測，蘿卜硫素能夠改善HDCP中胎盤滋養細胞的異常凋亡現象。

越來越多的證據表明，高血壓是由補體、炎性體的激活以及循環免疫細胞中髓樣細胞表型改變所引起[13]，因此炎癥反應也是高血壓的發病機制之一。各炎癥過程之間相互依賴，最終通過涉及氧化應激、內源蛋白質修飾以及抗原加工和呈遞機制的改變參與適應性免疫反應。同樣，在HDCP患者血清中檢測到多種炎癥因子出現不同程度的變化，并且能夠反映HDCP病情嚴重程度[14]。本研究結果顯示，L- NAME干預的HTR- 8/SV- neo細胞中TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量增加，該結果也表明在L- NAME誘導模擬的HDCP微環境中出現了炎癥反應，而經10、20、40 μmol·L- 1蘿卜硫素作用的細胞，TNF- α、IL- 1β和IL- 6含量均明顯減少，由此表明蘿卜硫素可能會抑制HDCP中胎盤滋養細胞的炎癥反應。

氧化應激反應是由活性氧與抗氧化能力之間的不平衡所導致的，是妊娠病理生理過程中的重要因素。當胎盤中的氧化應激超過抗氧化劑防御機制的能力時，氧化損傷會擴散到其他組織。由氧化應激引起的內皮功能障礙與妊娠并發癥，包括先兆子癇、早產和反復流產的發病機制有關[15- 17]。SOD和GSH具有抗氧化物酶性質，能夠通過協同清除ROS和自由基來減輕氧化性損傷；MDA是脂質過氧化產物，含量的高低可體現氧化反應的狀態[18]。本研究結果顯示，L- NAME干預的HTR- 8/SV- neo細胞中SOD、GSH活性降低，而MDA含量增加，10、20、40 μmol·L-1蘿卜硫素作用后再經NAME干預，細胞中SOD、GSH活性明顯升高，MDA含量則減少，這表明蘿卜硫素可能會對HDCP內氧化應激反應起到有效的抑制作用。

JNK/p38MAPK信號通路激活后，可通過與底物結合參與炎癥反應、細胞增殖與凋亡等過程[19]。本研究結果顯示，經L- NAME干預的HTR- 8/SV- neo細胞中p- JNK與p- p38MAPK 蛋白表達水平均升高，而預先使用20、40 μmol·L-1蘿卜硫素處理能夠抑制p- JNK和p- p38MAPK的蛋白表達水平。此外，進一步研究發現，在L- NAME干預的HTR- 8/SV- neo細胞中預先加入JNK/p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580處理，結果與蘿卜硫素處理細胞再經L- NAME干預的效果一致，即阻斷JNK/p38MAPK信號通路能夠抑制L- NAME誘導的HTR- 8/SV- neo細胞內氧化應激水平和炎癥反應，減少細胞凋亡。這一結果提示，蘿卜硫素可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活從而發揮對HDCP中胎盤滋養細胞的保護作用。

綜上，蘿卜硫素可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活來降低L- NAME誘導的HTR- 8/SV- neo細胞中氧化應激水平，并抑制炎癥反應及細胞凋亡。本研究通過在體外利用L- NAME誘導HTR- 8/SV- neo細胞模擬HDCP微環境，闡明了蘿卜硫素的作用及其機制，這為臨床治療HDCP的藥物研發與應用提供了理論依據。