丙泊酚介導miR- 637/STAT3軸調控肝癌細胞生長的相關機制研究

張琦，孫鵬，郭陽，谷月舜

(1.陽谷縣人民醫院 麻醉科，山東 聊城 252300； 2.陽谷縣人民醫院 普外科，山東 聊城 252300；3.聊城市人民醫院 神經內科，山東 聊城 252000)

全球范圍內，肝癌的病死率占所有惡性腫瘤疾病的第3位，盡管近年來肝癌的早期診斷和治療技術有一定的進步，但肝癌患者預后并不樂觀，術后轉移率和復發率仍處于較高水平[1]。因此，探究肝癌轉移和復發機制，將對靶向治療藥物的開發有重要意義。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥物，可用于腫瘤根治術的全身麻醉，據報道，丙泊酚對肝癌[2]、胃癌[3]、子宮內膜癌[4]等多種惡性腫瘤均具有抑制作用。周橋靈等[5]研究發現，丙泊酚可抑制人肝癌HepG2細胞的侵襲，可能與抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路的激活有關。但丙泊酚在肝癌中是否還有其他的作用途徑尚不明確。本研究通過探究丙泊酚對肝癌細胞生長的影響及其分子機制，以期為肝癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人肝癌HepG2細胞株購自上海細胞生物醫學研究所。

1.2 藥品與主要試劑

丙泊酚注射液(北京費森尤斯卡比醫藥有限公司，國藥準字J20171055，規格為每支20 ml)，細胞計數試劑盒- 8(cell counting kit- 8，CCK- 8)、蛋白質定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，磷脂結合蛋白V- 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V- fluorescein Isothiocyanate/ propidium iodide，Annexin V- FITC/PI)凋亡試劑盒(南京建成生物工程研究所)，基質膠、轉移小室(美國BD)，切割后天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase- 3，ab214430)、B淋巴細胞腫瘤- 2(B- cell lymphoma- 2，Bcl- 2，ab196495)、Bcl- 2相關蛋白X(Bcl2- associated X,Bax，ab3191)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)- 2(ab92536)、MMP- 9(ab228402)、信號轉導及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3，ab119352)、磷酸化STAT3(STAT3 phosphorylation，p- STAT3，ab76315)蛋白抗體(美國Abcam)，Trizol試劑(美國Invitrogen)，熒光定量試劑盒(日本TaKaRa)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與分組 用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基混勻HepG2細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，隔天采用0.25%胰蛋白酶液消化細胞，按1∶2的比例進行傳代培養。密切觀察細胞生長狀態，取對數生長期細胞隨機分為對照組和丙泊酚低、中、高劑量處理組，對照組添加正常培養基，丙泊酚處理組分別添加10、25、50 μg·ml-1丙泊酚[6]，處理后置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養。

1.3.2 細胞增殖能力測定 各組細胞接種96孔板，處理結束后分別培養24、48、72 h，添加CCK- 8試劑繼續培養4 h，經iMark酶標儀(美國RioRad)檢測570 nm處光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率[=(1-OD丙泊酚處理組)/OD對照組×100%]。

1.3.3 細胞凋亡測定 收集各組處理后細胞，調整濃度至1×106個·ml-1，加入結合緩沖液重懸細胞，混勻后分別加入AnnexinV- FITC、PI染液，4 ℃避光條件下孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.4 細胞侵襲能力測定 預先將基質膠鋪于轉移小室上室，凝固后添加處理后的細胞(無血清培養基)，下室添加含有20%胎牛血清的培養基，正常條件培養24 h。將轉移小室固定于4%多聚甲醛中，再經結晶紫染色10 min，用棉簽輕輕拭去上室細胞，光鏡(日本Olympus)下計數并拍攝下室細胞。

1.3.5 細胞遷移能力測定 收集各組處理后細胞鋪于6孔板，待細胞貼壁后，用1 ml槍頭于培養孔中線垂直劃線，洗去脫落細胞繼續培養，于0、24 h時拍照記錄，以細胞劃痕修復速度表示遷移率[=(劃痕距離24 h-劃痕距離0 h)/劃痕距離0 h×100%]。

1.3.6 細胞中相關蛋白表達測定 收集各組處理后細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，經蛋白質定量試劑盒檢測蛋白濃度后，各組取等量蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠切成合適大小轉移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉中封閉非特異性位點，分別加入1∶1 000稀釋的蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，再加入1∶10 000稀釋的蛋白二抗，37 ℃孵育40 min，最后進行化學發光顯示蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值與甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3.7 細胞中miR- 637表達測定 收集各組處理后細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，經微量核酸儀檢測樣品RNA純度和濃度，逆轉錄為cDNA鏈，參照熒光定量試劑盒配制反應體系，反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共38個循環，miR- 637相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR- 637上游引物序列5′- ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU- 3′，下游引物序列5′- ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGU- 3′；U6上游引物序列5′- CGCTTCGGCAGCACATATTAC- 3′，下游引物序列5′- TTCACGAATTTGCGTGTCCAT- 3′[7]。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞增殖情況

隨著細胞培養時間的延長，各組細胞的增殖抑制率均逐漸升高。同一培養時間點，丙泊酚處理組細胞增殖抑制率較對照組升高(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組HepG2細胞增殖抑制率的比較

2.2 細胞凋亡情況

如圖1，對照組和丙泊酚低、中、高劑量處理組細胞凋亡率分別為(0.35±0.11)%和(4.21±0.62)%、(9.48±2.35)%、(19.47±4.17)%，各組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(F=58.941，P<0.001)。丙泊酚處理組細胞增殖抑制率較對照組升高(P<0.05)，不同劑量丙泊酚處理組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組HepG2細胞凋亡情況

2.3 細胞侵襲與遷移情況

丙泊酚處理組侵襲細胞數和遷移率較對照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 各組HepG2細胞侵襲細胞數和遷移率的比較

圖2 各組HepG2細胞侵襲與遷移情況 A.各組HepG2細胞侵襲情況(×400)； B.各組HepG2細胞遷移情況

2.4 細胞凋亡、侵襲及遷移相關蛋白的表達

丙泊酚處理組中cleaved caspase- 3表達較對照組升高，Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平較對照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間cleaved caspase- 3、Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、表3。

1、2、3、4依次為對照組及丙泊酚低、中、高劑量處理組

2.5 細胞中miR- 637/STAT3表達情況

丙泊酚處理組細胞中miR- 637表達較對照組升高，p- STAT3/STAT3水平較對照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間miR- 637、p- STAT3/STAT3水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、表4。

1、2、3、4依次為對照組及丙泊酚低、中、高劑量處理組

表4 各組HepG2細胞中miR- 637/STAT3表達的比較

3 討 論

近期研究顯示，丙泊酚在調節圍手術期免疫與腫瘤的相互作用中有重要作用，可延長各種類型腫瘤患者的生存時間[8]。Yu等[9]研究發現，丙泊酚可促進miR- 328表達，抑制去整合素金屬蛋白酶8的表達，從而抑制胰腺癌細胞的增殖和轉移。維持長期增殖和運動能力是癌細胞最根本的特性，本研究以HepG2細胞為研究對象，檢測了丙泊酚對HepG2細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響，結果顯示，丙泊酚可顯著抑制HepG2細胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導細胞的凋亡。Sun等[10]研究也顯示，丙泊酚可調控肝細胞癌細胞的生長與轉移。

細胞凋亡是細胞自主死亡過程，涉及凋亡誘導因子和凋亡抑制因子等調節因子的相互作用，對維持機體生長發育、細胞分化及病理生理狀態有重要作用。正常情況下，細胞線粒體中Bcl- 2與Bax結合形成二聚體抑制細胞調亡；當受到外界刺激后，Bax水平升高形成更多的二聚體，聚集于線粒體膜增加其通透性，致使多種凋亡因子進入細胞質，激活caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡[11]。MMP- 2和MMP- 9是MMPs家族中降解Ⅳ型膠原主要的酶類，具有降解細胞外基質和基膜、促進新生血管生成、調節細胞間黏附作用等作用，可參與腫瘤細胞的侵襲與遷移的調控[12]。研究報道，肝癌中MMP- 2和MMP- 9表達升高，其表達水平與肝癌的發生及侵襲轉移機制有關，抑制其表達可顯著降低肝癌細胞的運動能力[13]。Kang等[14]應用丙泊酚處理MA- 10小鼠間質瘤細胞，結果顯示，丙泊酚可能通過激活caspase通路，抑制MA- 10細胞中蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路，從而誘導其凋亡。吳悠等[15]研究發現，丙泊酚可下調轉化生長因子β1，下調MMP- 9水平，抑制乳腺癌細胞MCF- 7細胞遷移和侵襲能力。本研究結果表明，丙泊酚可上調cleaved caspase- 3表達，下調Bcl- 2/Bax、MMP- 2和MMP- 9表達，誘導HepG2細胞凋亡，并抑制其侵襲與遷移。

miRNAs通過堿基互補配對與靶基因信使RNA的3′- UTR結合，介導靶基因的表達，從而在腫瘤的增殖、轉移和對藥物的敏感程度中起調控作用。據報道，miR- 637在肝癌、甲狀腺癌中表達下調，miR- 637過表達可抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為[16- 17]。STATs是一類細胞質轉錄因子，可調節相關基因的轉錄，從而參與細胞的增殖、分化、炎癥反應及免疫反應等過程[18]。STAT3作為STATs成員，可促進細胞持續性增殖，在惡性腫瘤中呈過度或持續激活狀態。Huang等[19]研究顯示，STAT3是miR- 637的靶基因，在骨肉瘤細胞的轉移機制中有重要作用。Li等[20]研究發現，丙泊酚可介導EGFR/JAK2/ STAT3通路，增強順鉑誘導的宮頸癌細胞凋亡。本研究結果顯示，采用丙泊酚處理后，細胞中miR- 637水平上調，STAT3磷酸化水平下調，提示丙泊酚可能介導miR- 637/STAT3軸，抑制肝癌細胞的生長與轉移。

綜上所述，丙泊酚可介導miR- 637/STAT3軸，抑制肝癌細胞的增殖、侵襲與遷移，并誘導其凋亡。但本研究僅在細胞水平檢測丙泊酚的作用，后期考慮選用動物模型，深入分析丙泊酚在肝癌中的作用。