PCSK9基因多態性與急性缺血性腦卒中患者發病風險及阿托伐他汀降脂作用的關系

鄒佳，潘雪，楊涌濤

(重慶市第五人民醫院 神經內科，重慶 400000)

在中國，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)具有高發病率、高致殘率和高死亡率等特點。目前針對脂質代謝功能障礙機制的治療，尤其是降低低密度脂蛋白(LDL)水平，可以有效改善患者預后[1]。阿托伐他汀是一種廣泛使用的降脂類藥物，具有較好的安全性和耐受性，然而AIS患者對他汀類藥物的治療反應差異較大。全基因組關聯分析研究表明，單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)不僅與血脂水平有關，還與他汀類藥物的治療效果有關。前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/溶菌素- 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是近年來發現的影響膽固醇穩態的主要因子，其機制可能與LDL相關受體(LDLR)的降解有關，也可能與神經發育有關[2]。而且有研究發現，PCSK9編碼區的罕見突變和常見變異都可能影響血漿LDL水平和中風風險[3]。然而PCSK9 SNPs是否會影響阿托伐他汀的治療效果尚不清楚，本研究旨在分析PCSK9基因多態性檢測對阿托伐他汀降低AIS患者血脂水平作用的影響，以期為臨床精準醫療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

從我院神經內科招募AIS患者119例，平均年齡(61.29±12.91)歲，所有患者均于2018年6月至2020年7月期間接受治療。納入標準：(1) 根據臨床表現、腦部磁共振成像(MRI)和(或)頭顱X線計算機斷層掃描(CT)診斷為AIS；(2) 首次發病時間<72 h，過去2周內無抗血小板、抗凝和溶栓治療史；(3) 有頸動脈超聲檢查和經顱多普勒檢查數據；(4) 漢族人群，在本地居住超過10年。排除標準：有顱內出血/中風史，高血壓，蛛網膜下腔出血，腦血管畸形，惡性腫瘤，動脈瘤，腦部手術史或創傷史，感染性疾病，自身免疫性疾病，嚴重心臟、腎臟或肝臟疾病。有任何阿托伐他汀過敏反應跡象的患者也被排除在外。所有患者都進行全身檢查、缺血性腦血管事件評估、用藥史詢問，以及MRI、頸動脈超聲檢查和經胸超聲心動圖檢查。另外納入同期在我院進行健康體檢的120例非心腦血管疾病者作為對照組，平均年齡(61.84±11.65)歲。納入標準：(1) 無已知腦血管疾病家族史；(2) 心肺檢查和神經系統檢查未發現異常；(3) sMRI檢查排除腦血管疾病。排除合并急性或慢性感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病者。本研究方案經醫院倫理委員會批準，且患者均簽署了知情同意書。所有患者每天口服阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051408，規格為每片20 mg)，每次20 mg，每天1次，共3個月。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有患者一般臨床資料包括年齡、性別、種族、體質指數(BMI)、高危因素[吸煙史(平均吸煙天數≥1 d、吸煙時間>1年定義為吸煙)、飲酒史(平均每周飲酒3次、每次超過50 g定義為飲酒)、高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病]，以及體格檢查(身高、體重、血壓、心率、體溫)、特殊檢查(心電圖、頸動脈超聲、血常規、血糖、血脂)結果。

1.2.2 實驗室檢測 分別于治療前后采集兩組患者10 ml清晨空腹靜脈血，采用全自動生化儀檢測患者血脂包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL- C)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)水平。另外采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法(試劑盒購自上海撫生實業有限公司)檢測患者血清PCSK9水平。

1.2.3 PCSK9基因多態性檢測 抽取5 ml空腹靜脈血液樣本置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，3 000 r·min-1離心5 min分離血漿。用標準酚- 氯仿法從外周血白細胞中提取基因組DNA，保存在-80 ℃，然后將基因組DNA樣本稀釋到50 ng·μl-1。使用Haploview 4.2軟件和HapMap- 人類基因組單倍型圖譜數據庫，以次等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)≤0.01和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)R2≥0.5作為閾值，篩選PCSK9基因3個SNPs基因型。采用單堿基延伸反應法(single- base terminal extension，SNaPshot)進行基因分型。將4.0 μl PCR產物與2- U堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)和2- U核酸外切酶Ⅰ(exonuclease Ⅰ，ExoⅠ)在37 ℃孵育60 min。經15 min酶滅活培養，將1 μl消化PCR產物與5 μl預反應混合物、1 μl引物和3 μl dH2O2混合。將該混合物置于熱循環儀中，經96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s后，加入0.5 U SAP，反應混合物孵育60 min。加入10 μl甲酰胺并95 ℃加熱5 min后，用ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀進行測序。

1.3 統計學處理

使用SPSS 26.0軟件處理所得數據。計量資料用均值±標準差表示，采用t檢驗和重復測量的方差分析，若存在組間×時間交互效應，則進一步進行單獨效應分析；計數資料以例及百分比表示，采用卡方檢驗；采用單因素和多因素Logistic回歸模型分析與AIS發生相關的臨床因素。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 對照組與AIS組PCSK9基因型及等位基因型分布比較

如表1所示，對照組與AIS組SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布差異具有統計學意義(P<0.05)，AIS組A及C等位基因型頻率較對照組更高。

表1 對照組與AIS組SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因型分布比較

2.2 PCSK9基因連鎖不平衡性分析

表2顯示了PCSK9基因的連鎖不平衡模式，以及它們的|D′|和R2值。|D′|值0.7～1表示在一對SNPs之間有很強的LD，|D′|值0.25～0.7表示中等LD，|D′|值0～0.25表示低LD。結果顯示，SNP1和SNP2的|D′|>0.7，具有強LD；SNP2和SNP3的R2值>0.5意味著SNP2和SNP3可以相互替換，它們不能同時構建單體型。SNP1和SNP2位于PCSK9基因外顯子9區域，SNP3位于內含子3區域，因此在進行多因素分析時只納入了SNP1和SNP2基因型。

表2 AIS組患者PCSK9基因連鎖不平衡性分析

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析PCSK9基因型與AIS發生的關系

經單因素和多因素Logistic回歸分析，吸煙史、高血壓史、慢性阻塞性肺疾病史、rs562556基因多態性分布都與AIS的發生風險密切相關(P<0.05)，見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析與AIS發生相關的因素

2.4 不同rs562556基因型AIS患者一般臨床資料比較

如表4所示，不同rs562556基因型的兩組(GG組與AG+AA組)患者年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、慢性阻塞性肺疾病史等資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 不同單倍體分型AIS患者一般臨床資料比較

2.5 不同rs562556基因型對阿托伐他汀降脂效果的影響

如表5所示，經重復測量的方差分析，血TC、TG、LDL- C及PCSK9水平隨治療時間不斷波動變化，治療前后水平存在差異，這種波動變化可能與rs562556基因型有關。(1) 時間效應：GG組及AG+AA組患者在不同檢測時間點時血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。(2) 組間效應：GG組與AG+AA組間血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。(3) 組間×時間交互效應：AG+AA組患者血TC、TG、LDL- C水平較GG組波動范圍小，而PCSK9水平波動范圍更大(P<0.05)。其他血脂指標包括HDL- C、ApoA1、ApoB水平在整個監測時間點和組間不存在交互作用(P>0.05)。單獨效應分析顯示：治療前，AG+AA組患者血TG、LDL- C水平高于GG組患者，PCSK9水平低于GG組患者(P<0.05)；治療后，兩組血TC、TG、LDL- C水平較治療前均降低，同時PCSK9水平升高(P<0.05)；且AG+AA組患者治療后血TC、TG、LDL- C水平低于GG組，同時PCSK9水平高于GG組(P<0.05)。

表5 不同rs562556基因型對阿托伐他汀降脂效果的影響

3 討 論

PCSK9是前蛋白轉化酶家族的第9個成員[4]，作為一種絲氨酸蛋白酶和分子伴侶，PCSK9通過內涵體/溶酶體途徑降低肝臟或肝外的LDLR水平，并增加血漿LDL- C水平，另外PCSK9還可調節ApoB的合成和分泌[5]。例如PCSK9的“功能增強”錯義突變與常染色體顯性高膽固醇血癥有關，而“功能喪失”的PCSK9無義突變與低LDL- C水平及降低心血管疾病的發病風險有關[6]。一些體內或體外研究也證實，PCSK9編碼區的罕見突變和常見變異(如rs529787、E670G等)都會影響血漿LDL水平和AIS發病風險[7- 8]。在本研究中我們發現，SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布在AIS患者與對照組間存在差異:對SNP1(rs562556)，AIS患者A等位基因頻率高于對照組(49.16%vs39.17%，P=0.008)；對SNP2(rs2479408)和SNP3(rs529787)，AIS患者C等位基因頻率亦高于對照組。表明隨著rs562556基因A等位基因頻率的增加或rs2479408/rs529787基因C等位基因頻率的增加，AIS發生風險也相應增加。在調整了性別、年齡、疾病史等因素后，rs562556基因多態性分布與AIS的發生風險密切相關，說明rs562556基因顯性模型(GGvsAG+AA)可以增加AIS的發病風險。

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見危險因素之一，與脂質代謝密切相關[8]，因此降脂治療是臨床上治療或預防AIS最常用的策略。阿托伐他汀是最有效的降脂藥物之一，可降低血清TC、TG和LDL- C水平，提高血清HDL- C水平[9]。并且大量研究和臨床實踐證實，阿托伐他汀通過降低血脂水平、縮小頸動脈斑塊面積和血管狹窄程度，可顯著降低冠心病缺血性腦卒中的發病風險，有利于縮短AIS患者的治療時間，改善患者預后[10]。此外，梁賦等[11]發現，瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀3種藥物均可有效降低大動脈粥樣硬化型覺醒型卒中患者的血脂水平，同時也會明顯提高血清PCSK9水平，這對降脂效果有一定的負面作用，因此對大動脈粥樣硬化型覺醒型卒中患者，臨床建議使用他汀類藥物聯合PCSK9抑制劑的方案，阿托伐他汀是其中一種藥效同時受遺傳因素和環境因素影響的藥物。一些薈萃分析證實，即使癥狀相似，AIS患者使用阿托伐他汀的有效性也存在差異，這表明基因多態性可能是影響藥物降脂作用的重要影響因素[12]。本研究結果顯示，經阿托伐他汀治療后，AIS患者血清PSCK9水平顯著升高，而且rs562556位點AG+AA基因型患者血清PSCK9水平升高更明顯，同時這部分患者血脂降低程度也小于GG組患者，說明rs562556位點AG+AA基因型可能是影響阿托伐他汀降脂作用的重要原因。PCSK9基因外顯子9區域rs562556突變變異位于催化結構域和C末端結構域之間的連接結構域，被認為屬于功能增強突變[13]，其錯義突變與頸動脈粥樣硬化斑塊、LDL- C和PCSK9水平獨立相關[14]。本研究數據也顯示，GG組患者血清PCSK9水平升高程度小于AG+AA組患者，這可能是影響阿托伐他汀降脂作用的重要原因之一。

綜上，rs562556基因顯性模型(GGvsAG+AA)可以增加漢族人群AIS的發病風險；同時這也可能是影響阿托伐他汀用于AIS患者降脂治療作用的重要因素，攜帶A等位基因者經阿托伐他汀治療后血清PCSK9水平升高明顯，這對于其降脂作用有一定的負面影響。未來有待更大的樣本量來進一步驗證我們的發現。