右美托咪定對老年結直腸癌患者術后認知功能及血漿miR- 206、BDNF水平的影響

陳小剛，汪正偉

(重慶兩江新區第一人民醫院 麻醉科，重慶 401147)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)被認為與全身性炎癥、神經細胞凋亡以及神經受損有關，在行結直腸癌手術的老年患者中發生率較高[1]。腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是神經元發育和記憶加工的關鍵因子，Wang等[2]在POCD大鼠海馬中觀察到給予右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)后緩解了大鼠相關的認知功能障礙和炎癥改變，并上調腦組織BDNF的表達，進而發揮一定的神經元保護作用。目前有研究發現miR- 206與BDNF的表達相關[3- 4]，但是尚缺乏臨床數據支持。本實驗擬研究DEX對老年結直腸癌患者術后認知功能及血漿微小RNA- 206(microRNA- 206,miR- 206)、BDNF水平的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料 招募2018年1月至2019年12月期間在我院計劃行全身麻醉腹腔鏡下結直腸癌根治性切除術、年齡60～80歲的患者160例，按照隨機數字表法將患者分為研究組和對照組兩組各80例。研究組男51例，女29例，年齡60～80歲，平均(68.64±6.37)歲，病程(0.71±0.26)年；對照組男44例，女36例，年齡60～80歲，平均(69.31±6.58)歲，病程(0.68±0.21)年。兩組年齡、性別、病程具有可比性(P>0.05)。本研究屬于前瞻性、隨機、對照研究，已經獲得我院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書后方可入組。

1.1.2 納入標準 (1) 年齡>60歲；(2) 美國麻醉醫師協會(American Society of Anesthesiologists，ASA)病情分級Ⅰ～Ⅲ級；(3) 術前簡易智力狀態檢查量表(mini- mental state examination，MMSE)評分≥23分；(4) 無溝通障礙。

1.1.3 排除標準 (1) 合并中樞神經系統損傷、心血管或呼吸系統疾病、肝腎功能障礙等；(2) 長期服用鎮靜劑、阿片類藥物、鎮痛藥或抗抑郁藥物者；(3) 有酗酒、吸煙或藥物依賴史；(4) 麻醉前心動過緩(心率<60次·min-1)；(5) 對試驗中所用藥物過敏或有禁忌證。

1.2 手術麻醉處理及患者生命體征監測

為了消除手術技巧的可能影響，所有手術都由同一個手術組完成。所有手術均在全麻下進行。為保持雙盲原則，麻醉準備和施行麻醉的麻醉醫師在緊急情況發生前不參與管理或評估。患者術前常規禁飲禁食和行其他術前準備，根據疾病的位置、程度和分期進行標準的腹腔鏡手術。用0.04 mg·kg-1咪達唑侖[規格為1 ml·(5 mg)-1，生產批號20171210，江蘇恩華藥業股份有限公司生產]、0.5 μg·kg-1舒芬太尼[規格為2 ml·(100 μg)-1，生產批號81A07207，宜昌人福藥業有限責任公司生產]、0.3 mg·kg-1依托咪酯[規格為10 ml·(20 mg)-1，生產批號20180102，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產]和0.6 mg·kg-1羅庫溴銨[規格為2.5 ml·(25 mg)-1，生產批號20180215A，浙江仙琚制藥股份有限公司生產]誘導麻醉。瑞芬太尼(規格為每針按C20H28N2O5計1 mg，生產批號80A07251，宜昌人福藥業有限責任公司生產)0.2～0.3 g·(kg·min)-1和丙泊酚[規格為10 ml·(0.1 g)-1，生產批號20180201，四川國瑞藥業有限責任公司生產]0.1～0.15 mg·(kg·min)-1維持麻醉，必要時采用順式阿曲庫銨(規格為每針10 mg，生產批號181119AK，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產)肌肉松弛。研究組患者麻醉前10 min給予DEX[規格為2 ml·(200 μg)-1，生產批號171021BP，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產]1 mg·kg-1，術中給予DEX 0.3 mg·(kg·min)-1(10 min后由醫生決定調整每例患者的輸液速度)至手術結束前30 min。對照組患者術中給予等量生理鹽水代替DEX。兩組患者術中予心電圖(ECG)、無創血壓、心率脈搏血氧飽和度(SpO2)監測。前額放置Narcotrend麻醉深度監測儀(Narcotrend- Compact，德國漢諾威醫科大學生產)，以記錄手術期間的Narcotrend值。麻醉指數保持在D1～E之間。術中靜脈輸注乳酸鈉林格注射液(規格為每瓶500 ml，生產批號D17100404- 1，四川科倫藥業股份有限公司生產)和羥乙基淀粉(每500 ml含30 g羥乙基淀粉，生產批號81M1642，北京益民藥業有限公司生產)，間歇性動脈血中含氧量分析，血紅蛋白<100 g·L-1或血細胞比容<0.3時輸注紅細胞懸液或冷凍鮮血漿。

1.3 觀察內容和指標檢測

1.3.1 基線資料 收集所有患者基線資料，包括年齡、性別、體質指數(BMI)、血壓、ASA病情分級等。

1.3.2 血漿miR- 206水平檢測 術前及術后1、3、7 d使用抗凝采血管采取清晨空腹外周靜脈血5 ml，3 500 r·min-1離心10 min，獲取血漿于-80 ℃保存待測。采用miRNeasy RNA分離試劑盒(Qiagen公司)按說明書提取血漿總miRNA。通過納米滴吸收光度法檢測RNA質量，僅將A260/280>2.0的RNA片段用于后續反應。逆轉錄使用miScript Ⅱ RT試劑盒(德國Qiagen公司)進行。此外，使用預先設計的針對靶向miR- 206的混合引物和Qiagen miScript PreAMP PCR試劑盒進行12個周期的預擴增，選擇小分子U6作為內源性參考基因。在7900 HT 快速實時PCR系統(美國Thermo Fisher scientific公司)上進行PCR擴增，以逆轉錄得到的cDNA為模板，采用Qiagen miScript SYBR Green PCR試劑盒進行擴增反應。擴增條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。用2-ΔΔCT公式對表達數據進行分析，用參考基因U6 mRNA對目標特異性擴增效率結果進行歸一化處理。每個樣本平均實驗3次。miR- 206引物序列：正向5′- CCGAGGCCACATGCTTCTTTA- 3′，反向5′- TTGCCGAAACCACACACTTC- 3′；U6 mRNA引物序列：正向5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC- 3′，反向5′- CAGGGCCATGCTAATCTT- 3′。

1.3.3 血漿BDNF水平檢測 在術前和術后1、3、7 d時，使用EDTA抗凝管各采取清晨空腹外周靜脈血2 ml，3 500 r·min-1離心10 min，獲取血漿于-80 ℃保存待測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，應用BDNF ELISA試劑盒(美國R&D公司)測定BDNF水平；所有血漿樣本用人BDNF免疫分析法進行雙重分析，每個微量滴定板連續測定一個內部對照樣本。樣本的分析間變異系數為11.2%，分析內變異系數為6.3%。

1.3.4 術后認知功能測試 神經心理測試由實驗前已經接受專業培訓的研究人員進行。大部分測試都由同一個核心小組的研究人員完成。在術前及術后3、7 d 時采用MMSE評價認知功能，內容包括時間定向力、地點定向力、即刻記憶、注意力及計算力、延遲記憶、語言、視空間。根據Rasmussen等[5]的建議，用術后評分減去術前評分計算可靠性變化指數(reliable change index，RCI)，當RCI至少在2次測驗中<-1.96 時定義為POCD。

1.3.5 不良反應發生情況 記錄手術開始至術后3 d出現的不良反應，包括低血壓、心率加快、心動過緩、呼吸抑制、惡心嘔吐等。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 對照組與研究組患者術前資料和術中情況比較

對照組與研究組患者年齡、性別、BMI、病程、飲酒史、ASA病情分級、術前MMSE評分、合并疾病史、Duke分期及術中代血漿用量、尿量、出血量、麻醉持續時間、手術時間等比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 對照組與研究組患者術前資料和術中情況比較

2.2 對照組與研究組患者手術結局比較

研究組患者術后3 d和7 d時POCD的發生率低于對照組(P<0.05)，住院時間短于對照組(P<0.001)；研究組患者睜眼時間和拔管時間長于對照組(P<0.05和P=0.001)；兩組患者術后不良反應發生率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 對照組與研究組患者手術結局比較

2.3 對照組與研究組患者手術前后血漿BDNF水平比較

重復測量設計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿BDNF水平差異具有統計學意義(F=268.228，P<0.001)；(2) 對照組與研究組患者血漿BDNF水平比較差異具有統計學意義(F=58.868，P<0.001)；(3) 對照組與研究組患者血漿BDNF水平變化趨勢比較差異具有統計學意義(F=30.265，P<0.001)。另外Post- hoc分析顯示，術后1、3、7 d時，研究組患者血漿BDNF水平高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 對照組與研究組患者手術前后血漿BDNF水平比較

2.4 對照組與研究組患者手術前后血漿miR- 206相對表達量比較

重復測量設計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿miR- 206相對表達量差異具有統計學意義(F=118.079，P<0.001)；(2) 對照組與研究組患者血漿miR- 206相對表達量差異具有統計學意義(F=374.532，P<0.001)；(3) 對照組與研究組患者血漿miR- 206相對表達量變化趨勢差異具有統計學意義(F=44.805，P<0.001)；另外術后1、3、7 d時，研究組患者血漿miR- 206相對表達量低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 對照組與研究組患者手術前后血漿miR- 206相對表達量比較

2.5 POCD組與非POCD組患者手術前后血漿BDNF水平和miR- 206相對表達量變化比較

根據術后7 d時是否發生POCD，將160例手術患者分為POCD組(n=21)與非POCD組(n=139)，比較兩組患者術前及術后1、3、7 d時的血漿BDNF水平和miR- 206相對表達量。重復測量設計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿BDNF水平和miR- 206相對表達量差異均具有統計學意義(BDNF：F=225.860，P<0.001；miR- 206：F=1089.637，P<0.001)；(2) POCD組與非POCD組患者血漿BDNF水平及miR- 206相對表達量差異均具有統計學意義(BDNF：F=837.256，P<0.001；miR- 206：F=1 793.458，P<0.001)；(3) POCD組與非POCD組患者血漿BDNF水平及miR- 206相對表達量變化趨勢差異均具有統計學意義(BDNF：F=165.430，P<0.001；miR- 206：F=572.819，P<0.001)。另外，與非POCD組相比，術后1、3、7 d時，POCD組患者血漿BDNF水平均較低，血漿miR- 206相對表達量均較高，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 POCD組與非POCD組患者手術前后血漿BDNF水平及miR- 206相對表達量比較

2.6 ROC曲線分析術后1 d時miR- 206相對表達量對POCD發生的預測價值

術后1 d時miR- 206相對表達量對患者術后3、7 d POCD的發生均有一定的預測價值，AUC分別為0.78(95%CI為0.67～0.84，P<0.001)、0.82(95%CI為0.71～0.89，P<0.001)。最佳閾值分別為4.15和4.10，靈敏度分別為84.5%和94.32%，特異度分別為64.98%和62.17%。見圖1。

圖1 術后1 d時血漿miR- 206相對表達量預測術后3、7 d POCD發生的ROC曲線 A.預測術后3 d POCD發生的ROC曲線； B.預測術后7 d POCD發生的ROC曲線

2.7 多因素Logistic回歸分析影響POCD發生的危險因素

將術后7 d時POCD的發生作為因變量(POCD=1，非POCD=0)，將術前(年齡、性別、BMI、病程、飲酒史、ASA病情分級、術前MMSE評分、合并疾病史、Duke分期)、術中(代血漿用量、尿量、出血量、麻醉持續時間、手術時間)相關指標及術后1 d血漿miR- 206相對表達量納入單因素Logistic回歸模型，結果顯示，術前MMSE評分、糖尿病史、DEX使用以及術后1 d時血漿miR- 206相對表達量與術后7 d時POCD的發生風險有關(P<0.05)；將上述變量納入多因素Logistic回歸方程，結果顯示，患者術后3 d和7 d時POCD發生的危險因素為有糖尿病病史、DEX使用以及術后1 d時血漿miR- 206相對表達量>4.10(P<0.05)。見表6。

表6 術后7 d時POCD發生的Logistic回歸分析

3 討 論

目前共識認為老年人群POCD的發生率比60歲以下人群更高，而且POCD多與患者術后恢復不良、住院時間延長、住院費用和長期康復需求較高以及死亡風險大有關[6- 8]。本研究中，術前10 min和術中給予DEX可降低老年(≥60歲)結直腸癌患者在腹腔鏡下根治手術后3 d和7 d內認知功能障礙的發生率。這與既往眾多研究[9- 10]結論一致，作者推測這可能與DEX具有抗炎及改善術后疼痛作用有關。DEX是一種高效、高選擇性的跨膜G蛋白偶聯中樞α2受體激動劑，可減少中樞神經系統交感神經流出，除降低血壓和心率外，還可提供鎮靜和鎮痛作用，而不會引起呼吸抑制[11]。除此以外，DEX的阿片類作用是眾所周知的。這些特性使其成為重癥監護病房和圍手術期患者鎮靜的合適選擇。但本研究由于納入的樣本量偏少，研究組與對照組老年患者術后低血壓、心率過緩、心動過速、呼吸抑制等不良反應發生率的差異未顯示統計學意義。此外有體外研究認為，長期使用DEX可活化PI3K/AKT信號通路，進而促進結直腸癌腫瘤細胞的增殖和遷移等[12]，但是這一點尚沒有臨床證據支持。而且作為麻醉用藥，DEX短時間內即可代謝，因此其對腫瘤細胞的影響幾乎可以忽略不計。

POCD是一個多因素的疾病模型，雖其發病機制并不清晰，但臨床普遍認為其是神經系統老化、麻醉、手術及術前病史等多種因素共同誘發的[13]。此外，很多基礎研究發現，BDNF在POCD發生過程中可能涉及沉默信息調節因子1信號通路的激活、NF- κB信號通路的抑制等[14- 15]。本研究也發現POCD患者血漿BDNF濃度在術后7 d內的變化與非POCD患者間差異具有統計學意義，而且在術后1、3、7 d時，POCD組患者血漿BDNF水平均顯著低于非POCD組患者，說明麻醉及手術過程誘導BDNF濃度增加可能是導致POCD發生的重要機制。BDNF是一類保護性的神經營養因子，廣泛分布于中樞神經、周圍神經及內分泌等系統，具有維持神經系統發育、促神經系統損傷修復等作用。Lü等[16]通過使用新生大鼠的海馬神經元細胞為模型，得出DEX可以通過上調BDNF的表達及N- 甲基- D- 天門冬胺酸受體磷酸化水平來實現神經保護作用的結論。同時Dong等[17]認為，DEX也可以通過減輕麻醉藥物對BDNF的抑制作用進而提高BDNF水平。這些基礎研究結論都很好地解釋了本研究結果。但是需要強調的是，血漿中BDNF水平受到血腦屏障的影響較大，因此并不能完全反映其腦內水平；而且不同手術類型可能造成的血腦屏障損害不同，這將干擾血漿BDNF水平作為POCD外周血循環標志物的敏感性。但是與BDNF蛋白表達相關的miRNAs則不易受到血腦屏障的影響，而且在神經元損傷早期即可表現出變化，因此在本研究中，我們期望尋找比BDNF更敏感的miRNAs用于POCD的臨床預測以及對POCD發生風險的評估。

BDNF轉錄本包含短非編碼區(BDNF- sh，350nt)和長非編碼區(BDNF- l，2891nt)。Xing等[18]證實，miR- 206對BDNF基因轉錄后翻譯有一定的抑制作用。除了長度，3′UTR的二級結構也影響BDNF mRNA的穩定性，其中部分是通過修改轉錄本中miRNAs靶點的可接近性。BDNF- l包含了調節轉錄穩定性所必需的莖環結構，這提高了二級結構的穩定性。因此到目前為止，只發現少數miRNAs可與BDNF mRNA結合，并參與BDNF水平的生理和病理性調節，其中就包括miR- 206。在本實驗中，我們首次通過臨床研究證實，術后1 d血漿miR- 206相對表達量變化對POCD有一定的預測價值。在這里需要強調的是，腫瘤本身對血漿miR- 206水平也有一定的影響，但是術前POCD組和非POCD組患者血漿miR- 206水平無顯著差異，而我們考察的是術后1 d時血漿miR- 206水平對POCD發生的影響，因此術后殘余腫瘤對血漿miR- 206水平的影響幾乎可以忽略。并且我們通過多因素Logistic回歸分析，盡可能校正多種術前和手術過程中混雜因素后得出，術后1 d血漿miR- 206相對表達量依然是老年結直腸癌患者POCD發生的獨立危險因素。

綜上所述，對于接受全麻手術的老年結直腸癌患者，POCD的發生可能與術后血漿miR- 206相對表達量升高及BDNF水平降低有關，尤其是血漿miR- 206相對表達量升高是POCD發生的獨立危險因素。而給予DEX，則可以明顯提高患者術后7 d內血漿BDNF水平，降低血漿miR- 206相對表達量，這可能是降低POCD發生風險的分子機制之一。本研究從分子機制角度進一步證實了DEX對手術和麻醉引起的神經組織損傷有一定的保護作用，從而可為DEX的臨床應用提供更可靠的實驗證據支持。

聲明：本文所有作者間不存在利益沖突。