濕熱證動物模型造模方法的文獻挖掘研究?

陳佳美， 朱 青,2， 樸勝華,2△， 郭 姣,2

(1.廣東藥科大學，廣東省代謝病中西醫結合研究中心， 廣州 510006；2.廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室， 廣州 510006)

濕熱證是臨床常見證候，以身熱不揚、口渴不欲多飲、大便泄瀉、小便黃、舌紅苔黃膩、脈滑數等為主要表現，以病情纏綿、病程較長為特點?！吨嗅t內科學》載病76種21種疾病[1]。既往濕熱證與急性感染性疾病關系密切，如急性病毒性肝炎[2]、急性胰腺炎[3]、登革熱[4]等。近年來，隨著疾病譜的改變，濕熱證越來越多見于慢性非傳染性疾病[5]，如2 型糖尿病及其并發癥[6，7]、慢性肝病[8]、慢性胃炎[9]、腎炎[10]等。但濕熱證參與疾病進展的生物學基礎尚不清楚，公認的、可以模擬臨床的濕熱證動物模型的構建，是開展相關研究的基礎工作和關鍵環節之一。

自1988年，郭金龍首次通過肥甘飲食和人工濕熱環境成功模擬濕阻證[11]，后續學者在此基礎上不斷改進。濕熱證動物模型涉及到動物種類、干預因素、評價指標等多方面，具體方法多達數十種，但目前尚無公認、成熟的濕熱證造模方法，因此亟需對目前已發表文獻中濕熱證動物模型造模方法進行系統的梳理和分析?；诖耍狙芯客ㄟ^提取近20年濕熱證動物模型文獻中的文本信息，從動物種類、干預因素、相關疾病、評價指標等幾方面進行文本信息挖掘，以期為濕熱證造模方法提供客觀數據支撐。

1 濕熱證動物模型文獻發表數量及機構分布情況

濕熱證動物模型文獻發表數量統計分析表明，2000年前濕熱證動物模型相關文獻研究較少，從2000年逐漸增多，2005～2014的10年間文獻發表數量激增，但近5年文獻數量又呈現下降趨勢(見圖1)。濕熱證動物模型研究機構的構成分析表明，濕熱證動物模型研究機構不僅包含廣州中醫藥大學、遼寧中醫學院、成都中醫藥大學等傳統中醫藥大學,也包括南方醫科大學、成都軍區總醫院等綜合性醫學院?；驒C構(見圖2)。

圖1 濕熱證文獻的發表時間(年)與數量

圖2 濕熱證模型涉及機構分布

2 濕熱證動物模型相關參數

2.1 動物選擇

圖3-5示，濕熱證動物模型的動物種類、年齡和性別的統計分析表明，濕熱證動物模型動物種類涉及到SD大鼠、豚鼠、新西蘭兔等8種動物，以sprague-dawley(SD)大鼠最常見；性別以雌雄各半應用最廣，總體上雄性高于雌性。對濕熱證大鼠年齡進行統計，體質量成為年齡的替代指標，體質量集中在180～220 g之間，以190～200 g區間頻次最多。

圖3 濕熱證動物模型種類使用情況頻次分布

圖4 濕熱證動物模型性別分布

圖5 濕熱證大鼠初始體質量情況分布

2.2 濕熱證動物模型的干預因素

表1圖6示，濕熱證的誘因包括內濕、外濕、體質、外邪和化學因素。其誘因的相關干預因素統計分析表明，濕熱證干預因素以高脂高糖飲食、濕熱環境、病毒/細菌、酒精、中藥干預、化學因素為常見，其占比分別為92.1%、91.3%、66.1%、22.8%、9.4%、8.6%；其他因素占2.3%，包括游泳，冷水浸泡等。

表1 濕熱證模型涉及的相關干預方法

圖6 濕熱證模型干預因素頻次分布

濕熱環境的溫度、濕度分析表明，溫度以32 ℃使用頻率最多，其次是35 ℃(見圖7)，相對濕度以95 %使用頻率最多(見圖8)。對生物因子種類進行統計發現，大腸埃希菌使用次數最多(見圖9)。僅少數文獻對飲食的配方進行詳細描述，但文獻分析中發現，濕熱證動物模型飲食的物理狀態各有不同，分析發現固態高脂高糖飼料使用最廣泛(見圖10)。

圖7 濕熱證動物模型溫度使用頻次分布

圖8 濕熱證動物模型濕度范圍使用頻次分布

圖9 濕熱證模型生物因子種類分布

圖10 濕熱證模型飲食物質形態構成分布

2.3 濕熱證動物模型的分類及疾病分布

表2-4示，濕熱證動物模型中38.6 %(49/127)為病證結合模型，61.4 %(78/127)為單純中醫證候模型。證候模型的分類按頻次依次為：脾胃濕熱證、溫病濕熱證、大腸濕熱證、濕熱證、肝膽濕熱證；病證結合動物模型涉及6大類疾病，按頻次依次為消化系統疾病、傳染病、皮膚病、呼吸系統疾病、泌尿系統疾病、代謝病，以及不同類型濕熱證造模方法及優缺點。

表2 濕熱證動物模型分類比較

表3 濕熱證病證結合動物模型的疾病分布

2.4 濕熱證動物模型評價標準

目前濕熱證臨床診斷標準主要包括《中醫臨床診療術語證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》《中醫病證診斷療效標準》。以上3個濕熱證診斷標準均是基于濕熱證臨床癥狀及體征來評判。由于人與鼠的種屬差異性，動物模型僅模擬部分臨床的癥狀、體征。目前濕熱證動物模型從癥狀、體征、微觀指標三個維度進行評價(見表5)，其中癥狀是最廣泛使用的評價手段，體征檢測相對癥狀觀察費時費力，故較少應用；而臨床和動物模型上證據一致的微觀指標，其應用尚未得到公認，仍需進一步探索。

表4 常見疾病的濕熱證動物模型造模方法及優缺點

表5 濕熱證動物模型評價維度及指征

3 討論

濕熱證動物模型文獻發表數量自2000年逐步增加，2005～2014年迅猛發展，表明國家對中醫藥事業的大力支持以及學術界對濕熱證候的重視，推動濕熱證動物模型研究不斷向前發展。雖然濕熱證領域越來越受到重視，但濕熱證動物模型尚未取得重大突破，其發展陷入瓶頸，因此近5年濕熱證動物模型研究漸漸陷入頹勢。濕熱證研究機構涉及不同地域，且傳統中醫藥大學和綜合性大學均對濕熱證開展了研究，表明濕熱證候不僅是中醫藥界關注的領域，同時也是現代醫學重視的方向。居于南方的學術機構對濕熱證動物模型研究更多，可能與嶺南地區特殊的地理環境、氣候條件及濕熱證高發有關。

SD大鼠是濕熱證動物模型最廣泛采用的動物，可能與大鼠血樣較易采集，表征較易觀察等因素，但大鼠是否是濕熱證最適宜的模型，還需要更多地對比研究提供證據。有研究發現，在輪狀病毒感染所致的大腸濕熱證動物模型中，BALB/c小鼠較Wistar大鼠更貼近大腸濕熱證模型[23]。比較登革熱病毒感染的4周齡BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠濕熱證模型，發現BALB/c小鼠在血小板、肝損傷、血脂方面變化更明顯[24]。不同種屬和品系的動物對同一致病因素易感性不同，不同疾病最適宜的濕熱證動物種屬還需要進一步研究。在性別的選擇上，濕熱證動物模型雄性動物總體高于雌性動物，可能與雌性發情周期會引起不良的實驗影響，且雄性動物受高脂飲食影響更為顯著有關[25]。

目前濕熱證動物模型大多使用“外濕”+“內濕”的造模方法，可同時復合“外邪”或“體質”因素，單因素化學藥物干預造模較少。高脂高糖飲食是內濕形成的重要因素，其物理狀態分為液態和固態兩種，在濕熱證的造模中以固體飼料為主，但固態飼料是否是最佳選擇尚缺乏相應的研究證據。飲食物理狀態的不同可造成喂食方式與攝取量的差異，如濕熱證模型進食量減少的前提下，液體灌服方式更能確保動物的攝食量，且研究表明液體飲食可增加食物攝入量，從而增加體內脂肪[26]。高脂高糖飲食是公認的造成肥胖、糖脂代謝紊亂的有效方法，而濕和水液代謝障礙密切相關，脂肪和糖的過量攝入對水液代謝的影響尚不完全清楚，但研究發現肥胖不僅僅是脂肪組織的過度聚積，同時也是一種低度的慢性炎癥狀態[27]。而炎癥與水液代謝障礙密切相關。在炎癥介質等多種因素作用下，毛細血管膜對液體和溶質的通透性增加，血管與間質的液體交換出現障礙，可使液體積聚導致水腫，從而產生一系列病理反應。

“外濕”是誘發濕熱證的重要條件，造模箱用于提供濕熱環境，在濕熱證動物造模中具有重要作用。其溫度集中在30 ℃～35 ℃、濕度在90 %～95 %之間，溫度32 ℃使用頻率最多，相對濕度以95 %使用頻率最多，但尚無對不同溫度、濕度的最優設定值進行的研究。研究表明，造模持續日期越長其模型越穩定，但其模型也僅持續4周[28]。但造模過程中濕熱環境、每日持續時長和持續日期尚無定論，最佳條件還需進一步深入探索。部分研究者用游泳或冷水浸泡作為外濕環境成功誘發濕熱證，表明濕度因素可能相對溫度更有益于濕熱證的形成。細菌、病毒、內毒素作為“外邪”在機體內通過快速炎癥效應，以促進濕熱證的形成，但對于慢性非感染性疾病、生物因子誘導的濕熱證“病理過程”與研究本意相悖。

為了更簡易快捷地造成濕熱證，部分研究者根據濕熱證特征性表征如舌苔黃膩、黃疸等為評價指標，選擇特定化學藥物進行造模。如文杰等用膽胰管推注5%?；悄懰徕c造急性胰腺炎大鼠模型，出現舌苔厚膩的達42.6 %[29]；皮膚黃疸是肝膽濕熱證的典型表征，曹洪欣等用異硫氰酸α-萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)和四氯化碳(carbontetrachloride)成功模擬濕熱黃疸[30]。這類單一因素的模型復制方法雖然復制出明顯的中醫證候表征，但忽略了病因是證候形成的關鍵因素之一，其應用存在一定的爭議。

本研究還發現，病證結合模型和單純中醫證候模型造模方法多有重合，如腹瀉病濕熱證[12]、大腸濕熱證[13]和溫病濕熱證[14]均使用相同的造模方法(高脂高糖飲食+濕熱環境+大腸埃希菌)，表明動物模型模擬臨床同一證候不同亞型存在技術上的困難和瓶頸，需要臨床研究提供不同證候亞型之間特征的標志物和表征，為證候動物模型研究提供可借鑒的標準，從而促進證候動物模型的發展。濕熱證動物模型主要涉及消化系統疾病、傳染病、代謝病等領域，這與濕熱證臨床研究結果一致[5]，但2型糖尿病濕熱證動物模型尚無文獻報道。實際上，越來越多的臨床研究表明，濕熱證是2型糖尿病的主要證候之一，其病證結合動物模型研究也將成為未來研究的重點和難點[7]。

臨床濕熱證診斷依據傳統“望聞問切”四診信息。由于動物與人在種屬上的固有差異，且在動物身上只能用望診、聞診，因此尋找客觀、特異性的癥狀和指標成為判斷濕熱證動物模型造模成功與否的關鍵。目前，舌紅、苔黃膩是公認的濕熱證診斷“金指標”。在《中醫臨床診療術語證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》《中醫病證診斷療效標準》中，濕熱證診斷標準的共性診斷條目為舌紅、苔黃膩，可見舌診是濕熱證的關鍵診斷指標。雖然舌診尚未普遍應用于濕熱證動物模型的診斷，但有研究者利用光學相干層析成像技術對動物舌苔進行分析，發現動物舌苔厚度分布與正常人體的舌苔分布相吻合；且發現脾胃濕熱證大鼠舌苔厚度明顯升高，而舌體含液量則明顯降低，與濕熱證明顯相關[31]，表明舌診有潛力成為濕熱證動物模型診斷指標。研究發現，某些炎癥[32]、免疫反應[33]、氧化應激[34]、水液代謝[35]、血液流變學[36]、神經內分泌[37]的指標與濕熱證密切相關，但此類指標缺乏特異性，其應用尚存在爭議。為更客觀的評價濕熱證動物模型，亟需發掘濕熱證的特異性指標協助診斷。

近年來，濕熱證獲得越來越多學者的關注，建立公認、成熟的濕熱證動物模型是重點也是難點。濕熱證動物模型干預因素眾多，造模方法多樣，各有其優缺點，不斷細化各實驗變量，進一步探索更符合臨床實際的濕熱證動物模型尤為重要，其中建立客觀、合理的濕熱證模型評價體系是濕熱證動物模型研究的關鍵環節。隨著現代科技水平的不斷發展，在大數據和多組學技術的協同作用下，將有望發掘出濕熱證的特異性、客觀化指標體系，進一步促進濕熱證動物模型的發展。