基于Mono Trap方法對醬油氣味活性成分的分析

王逍君， 孟 琦， 宋煥祿

(北京工商大學 食品與健康學院， 北京 100048)

醬油是我國傳統發酵調味品，是以大豆或脫脂大豆輔以小麥、麩皮等為原料，經多種微生物協同發酵，制得的具有特殊風味與顏色的液體調味品[1-3]。氣味特征是影響醬油品質高低的重要因素之一。目前，國內外對醬油香氣成分的富集方法主要有頂空固相微萃取(HS- SPME)法[4-6]、溶劑輔助風味蒸發(SAFE)法[7-10]、液液萃取(LLE)法[11]、同時蒸餾萃取(SDE)法[12]、攪拌棒吸附萃取(SBSE)法[13]、動態頂空制樣(DHS)[12]等，其中固相微萃取(SPME)法和液液萃取法使用最為廣泛。SPME簡單無需使用有機試劑，但對于高沸點低揮發性氣味化合物的萃取效果不佳；SDE在煮沸樣品的過程中會導致樣品中原有氣味活性物質的分解或生成新的氣味化合物[14]，其分析結果無法保證醬油中原有氣味成分的真實性；SBSE受涂層材料的限制，對氣味活性化合物的吸附效果有限。

固相萃取整體捕集劑(monolithic material sorptive extraction，Mono Trap)是一種新型萃取材料，集硅膠、活性炭、十八烷基硅烷特性為一體的高交聯性吸附劑。Mono Trap硅膠骨架里混合了活性炭，對極性物質、低沸點物質、芳烴具有較好的吸附作用，可吸附分散在任何基質中的高揮發性、低揮發性、極性、非極性、液態及氣態物質[15]。Lu等[16]應用Mono Trap對常見亞洲鯉魚肉的特征氣味物質進行了研究，結果顯示化合物的萃取效果良好；Fu等[17]利用Mono Trap結合GC- MS和電子鼻建立熱氧化體系，研究中華絨螯蟹中關鍵脂類物質；Jang等[18]對Mono Trap結合GC- MS測定馬纓丹香氣化合物的萃取條件進行了優化。但是，將Mono Trap新型萃取材料應用于醬油氣味活性成分的研究還較少。

本研究以高鹽稀態釀造醬油為研究對象，使用Mono Trap結合熱脫附以及GC- O- MS對氣味活性化合物進行萃取與分析，通過優化萃取條件建立分析方法；同時使用SPME萃取相同醬油樣品并進行GC- O- MS分析，將Mono Trap與SPME的分析結果進行對比。研究結果將為進一步深入探究醬油的風味成分提供一定的理論支持與幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鹽稀態釀造醬油，千禾味業食品股份有限公司；C6～C30的正構系列烷烴，色譜純，美國Sigma公司；Mono Trap(RGPS- TD、RSC18- TD、RGC18- TD)，日本島津- GL Sciences公司。

1.2 儀器與設備

7890A- 7000B型GC- MS聯用儀、DB- Wax色譜柱，美國Agilent公司；Sniffer 9000型嗅聞儀，瑞士Brechbuhler公司；多功能自動進樣器(multipupose sampler，MPS)、熱脫附系統(thermal desorption system，TDS)、PTV冷卻型進樣口(cooled injection system，CIS)、玻璃襯管，德國Gerstel公司；MYP19- 2型恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1萃取條件的正交試驗設計

Mono Trap方法是一種較為新型的樣品前處理方法。為確定最佳的萃取條件，參照趙謀明等[5]以及顧賽麒等[19]的方法并稍作修改，設計L9(34)正交試驗(見表1)，確定Mono Trap方法的最優萃取條件。Mono Trap使用前在250 ℃ TDS中老化1 h，載氣流量1.2 mL/min。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.2萃取方法

1.3.2.1 固相微萃取方法

參照趙謀明等[5]對醬油的萃取方法并稍作修改。樣品使用前放于原商品包裝瓶中不開封，于4 ℃冰箱保存。實驗時，準確量取10 mL醬油于40 mL頂空瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)作為內標物。45 ℃下保溫平衡20 min，用75 μm CAR/PDMS萃取頭在45 ℃下萃取40 min，萃取結束后在GC進樣口230 ℃下解析5 min。2個樣品間萃取頭250 ℃老化10 min，以防止樣品間相互污染。

1.3.2.2 固相萃取整體捕集劑萃取方法

將1個Mono Trap RGPS- TD(MTRGPS- TD)放入樣品瓶中，使其完全浸入到醬油液體中，置于恒溫磁力攪拌器上進行吸附萃取，待萃取完畢后，將MTRGPS- TD取出，用超純水沖洗后再用濾紙吸干水分，最后將MTRGPS- TD置于熱脫附裝置中解吸附，進行GC- O- MS分析。

1.3.3GC-O-MS分析條件

GC條件：色譜柱DB- Wax(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；載氣為99.999%氦氣，流量1 mL/min；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；進樣方式為不分流。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測器溫度250 ℃；掃描模式為全掃模式，質量掃描范圍m/z40～500。

TDS條件：不分流模式；熱解吸程序為起始溫度40 ℃，60 ℃/min升到260 ℃，保持5 min。

CIS條件：液氮制冷，起始溫度-50 ℃，平衡1 min，12 ℃/s升至250 ℃，保持1 min。

嗅聞儀條件：Sniffer 9000型嗅聞儀傳輸線溫度250 ℃，嗅聞口用氮氣探入超純水瓶補充水蒸氣，嗅聞口溫度200 ℃。每個小組成員在嗅聞前都經過培訓，以便熟悉各種氣味描述。5名小組成員快速準確記錄從嗅聞口中感受到的流出物的氣味特征和時間。

1.3.4揮發性化合物定性與定量分析

揮發性化合物的定性通過與NIST11譜庫進行比較。同時根據相同色譜條件下標準品保留時間和相同色譜條件下C6～C30正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數(RI)，并與文獻報道的RI進行比對。定量分析方法以對醬油中揮發性化合物進行分離鑒定時添加的質量濃度0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮為內標物，通過內標物的峰面積與氣味活性化合物的峰面積比值計算各物質的含量。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010計算各氣味化合物的相對含量，使用Origin軟件對各化合物的含量繪制熱圖并進行分析。

2 結果與分析

2.1 Mono Trap方法萃取參數的正交優化結果

在食品風味化學分析中，將樣品的儀器分析結果與感官評價相結合能夠更為準確地反映出實驗方法對樣品風味特征的還原度。因此，在優化Mono Trap方法萃取參數時，使用GC- O- MS來驗證萃取化合物的氣味活性，以保證方法優化結果的有效性。在此基礎上檢測到的氣味活性化合物的峰面積能夠代表萃取方法對化合物的萃取量。在保證GC- O- MS嗅聞得到的樣品氣味屬性符合樣品實際氣味特征的前提下，檢測得到的氣味活性化合物的數量與峰面積可以反映出萃取條件的優劣。因此，本研究以嗅聞到的氣味活性物質總數和這些物質的峰面積為優化指標。

萃取條件優化的正交試驗結果及分析見表2、表3。捕集劑種類、萃取時間、萃取溫度都對氣味化合物的吸附萃取結果有影響，因素水平組合為A3B3C2時，Mono Trap方法具有較佳的萃取效果。

表2 Mono Trap方法正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal experiment for Mono Trap method

表3 正交試驗方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal experiment

同時，極差分析和方差分析結果表明，3個因素對Mono Trap 吸附萃取醬油氣味化合物的影響由大到小依次為捕集劑種類、萃取溫度、萃取時間。根據嗅聞到的氣味物質總數，最終選定固相萃取整體捕集劑RGC18- TD、萃取時間60 min、萃取溫度50 ℃為本研究中Mono Trap方法后續使用的優化萃取方法。

2.2 驗證實驗結果

使用優化后的Mono Trap方法對醬油重復萃取3次，計算嗅聞到的氣味化合物總峰面積，并對3次重復實驗之間的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)進行計算，驗證方法的可重復性。醬油中含量較高、帶有顯著花香、蜂蜜味的苯乙醇是醬油典型氣味特征的代表化合物。因此，本研究以苯乙醇為例，計算實驗方法的加標回收率。向2個醬油樣品中分別加入2種不同質量濃度的苯乙醇標準溶液10 μL(1 000、5 000 μg/mL)，采用GC- MS對其進行分析，計算加標回收率[見式(1)]，對優化得出的Mono Trap方法的有效性進行驗證。

(1)

加標回收率結果如表4。高添加量下，該方法對苯乙醇的回收率為112.52%；低添加量下，該方法對苯乙醇的回收率為109.12%，均在80%～120%，說明該方法的可重復性和準確度良好，適用于醬油的氣味化合物分析。

表4 醬油中苯乙醇的加標回收率Tab.4 Recoveries of phenylethyl alcohol in soy sauce

2.3 Mono Trap和SPME方法對醬油中氣味活性物質的鑒定比較

分別通過Mono Trap和SPME方法將醬油樣品中的揮發性成分提取出來，進行GC- O- MS分析。2種方法從醬油樣品中共鑒定出61種氣味活性成分，見表5。其中醇類11種、醛類7種、酮類5種、呋喃及呋喃酮類6種、含硫化合物4種、酯類11種、酚類3種、吡嗪類11種、有機酸類2種、其他化合物1種。不同萃取方式下香氣活性化合物含量熱圖見圖1。其中使用SPME方法共嗅聞到55種氣味活性化合物,質量濃度共計3.05 mg/L;使用Mono Trap方法共嗅聞到56種化合物，質量濃度共計12.63 mg/L。醬油的氣味活性物質多為極性化合物，例如醇、酸、呋喃酮和酚類化合物等。Mono Trap方法的捕集劑中包含有ODS C18成分，其對極性化合物的吸附能力較強，這也可能是這種方法能夠檢測出更多氣味活性物質的原因之一。

醬油中含有豐富的醇類化合物。其中乙醇的含量最高，是發酵過程中由酵母代謝產生的代表性氣味活性物質。除此之外，具有花香氣味的苯乙醇，被認為是醬油的關鍵氣味活性物質。由表5和圖1可知，Mono Trap方法共檢測到的這兩種醇類化合物的含量分別是SPME方法檢測到的1.6倍和4.6倍。從檢測到的醇類化合物整體來看，Mono Trap方法共檢測到醇類氣味活性化合物9種，總質量濃度為4.42 mg/L；SPME共檢測到11種，總質量濃度為2.18 mg/L。因此，就醇類化合物而言，Mono Trap方法捕捉或富集化合物的能力更強。

表5 Mono Trap與SPME方法對醬油樣品中氣味活性成分鑒定結果Tab.5 Identification results of odor-active components in soy sauce samples by Mono Trap and SPME

續表5

*1～61的數字編號分別對應表5中相應序號的化合物。SPME1～SPME3、Mono Trap1～Mono Trap3為3次平行實驗。圖1 不同萃取方式下醬油香氣活性化合物的含量熱圖Fig.1 Heat map of odor-active compounds in soy sauce

酯類化合物具有典型的水果特征。醬油中含有多種酯類化合物，以乙酸乙酯為主，其次為乳酸乙酯等。這些化合物主要由發酵過程中生成的有機酸和醇類物質通過酯化反應生成，是醬油風味中的代表物質。表5中，Mono Trap和SPME方法檢測到酯類氣味活性化合物的種類和數量基本相同，Mono Trap方法萃取到的總物質含量稍低于SPME。Mono Trap和SPME方法對酯類氣味活性化合物種類方面的萃取能力相差不大，但SPME富集到的化合物含量更高，這可能是由于酯類化合物揮發性較高，因此在樣品的頂部空間比樣品內部能萃取到更多的化合物。

醛、酮類氣味活性化合物一般具有麥芽味、青草味、甜味等[20]，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛等。Mono Trap方法中共檢測到醛、酮類氣味活性物質12種，總質量濃度6.24 mg/L；SPME共檢測到醛、酮類氣味活性物質10種，總質量濃度0.25 mg/L。就醛、酮類化合物而言，Mono Trap方法能富集到的物質含量更高。

醬油中有機酸類物質主要為乙酸，其次還有丙酸、丁酸等。酸類物質具有酸香，可中和醬油的咸味，還可與酵母代謝產生的醇類反應生成酯類化合物。Mono Trap方法共檢測到酸類氣味活性物質2種，總質量濃度1.15 mg/L；SPME方法共檢測到酸類氣味活性物質1種，總質量濃度0.11 mg/L。就酸類化合物而言，Mono Trap方法檢測到的化合物含量均高于SPME方法。

酚和吡嗪類化合物在醬油中含量較低，但卻是醬油中非常重要的氣味化合物，能貢獻烤香、煙熏味。Mono Trap方法共檢測到酚、吡嗪類氣味活性物質13種，共370.61 μg/L；SPME方法共檢測到酚、吡嗪類氣味活性物質14種，共80.47 μg/L。就酚、吡嗪類化合物而言，Mono Trap方法萃取到的氣味化合物的含量高于SPME方法。

呋喃和呋喃酮類物質對醬油氣味特征的形成至關重要，尤其是2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮和5-甲基-2-乙基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮，這2種化合物具有焦糖香，在水溶液中呈現出典型的醬油類氣味特征，但由于其相對分子質量較大，揮發性相對較低，很難通過SPME方法檢測出結果。由表5可知，這2種化合物僅在Mono Trap方法中檢測到。就總體而言，Mono Trap方法共檢測到這類氣味活性物質6種，總質量濃度204.25 μg/L；SPME方法共檢測到呋喃類氣味活性物質4種，總質量濃度34.24 μg/L。因此， Mono Trap方法在呋喃酮類化合物的萃取及物質含量的富集上較SPME更具優勢，可以更好地吸附萃取具有典型醬油氣味特征的化合物。

3 結 論

本研究將Mono Trap技術、熱脫附和GC- O- MS分析相結合，鑒定了醬油中的氣味活性物質；以Mono Trap捕集劑類型、萃取時間和萃取溫度為參數通過正交試驗，優化確定了適用于醬油氣味活性成分分析的Mono Trap方法的萃取條件，即捕集劑RGC18- TD、萃取時間60 min、萃取溫度50 ℃。實驗結果表明：與經典分析方法SPME相比，使用Mono Trap-GC- O- MS分析方法可以檢測出更多具有醬油氣味特征的化合物。定量分析顯示：Mono Trap方法在提取氣味活性物質方面具有萃取量大和回收率高的特點，特別是醇、醛、酸、酮、吡嗪、酚類等化合物的萃取濃度都比SPME方法高。在酯類化合物方面，SPME和Mono Trap方法的萃取能力幾乎相同。因此，在醬油的香氣成分萃取上，Mono Trap方法比SPME更有優勢。這可以歸因于醬油的大部分香氣活性化合物均為極性化合物，而Mono Trap對極性化合物的吸附能力更強，有效吸附面積更大，特別是可以吸附到更多的揮發性相對較弱的關鍵氣味活性化合物，例如呋喃酮類化合物。這一方法有望成為今后醬油氣味活性成分分析的有效研究方法之一。