仿草包曲在黃酒發酵中的應用及其對黃酒風味的影響

周志立， 劉雙平， 徐岳正， 周建弟， 應維茂， 毛 健，*

(1.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室/食品學院， 江蘇 無錫 214122；2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司 國家黃酒工程技術研究中心， 浙江 紹興 312000；3.江南大學(紹興)產業技術研究院， 浙江 紹興 312000)

黃酒的特色是“以麥制曲，以曲釀酒”[1]，因此，作為黃酒發酵過程中重要的糖化劑與產香劑[2]，生麥曲對黃酒的品質與風味具有至關重要的影響。黃酒生麥曲歷史悠久，歷史上有過多次工藝改進，其中草包曲工藝是紹興地區黃酒釀造的重要傳統工藝[3]。草包曲與塊曲都屬于生麥曲。1973年以前生產黃酒，由于紹興地區人工制曲時使用長桿稻草包裹曲塊，所以稱為“草包曲”，后受到當地種植矮腳稻的影響，可以制作草包曲的稻草來源逐漸減少；再加上傳統草包曲制作工藝要求“上三縛松，下三縛緊”，工序繁重，因此越來越難以滿足現代生產需要[4]。隨著機械化制曲程度的提高，傳統的草包曲逐漸被現代的機械塊曲取代。機械制作的塊曲節約人力、效率高、一次成型、標準化程度高，但存在“干皮”、過實、生產季節性與延滯性等問題[5-7]。因此，對生麥曲發酵工藝進行現代化改進及評價具有十分深遠的意義[8]。

目前，關于黃酒生麥曲的評價研究主要集中在生麥曲的群落結構對黃酒風味的影響[9-11]，以及不同種類或用量的生麥曲對黃酒發酵的影響[12-13]，也有研究利用組學技術研究生麥曲中的微生物與代謝物的相關性[14]，而對草包曲的相關應用研究較少。近年來，關于自動化制生麥曲的相關研究也表明：曲箱制曲是智能化的重要前提[15]，但基于曲箱制曲對傳統草包曲的工藝仿制與評價的相關研究仍處于初階水平。本研究通過對傳統草包曲的發酵環境進行分析與模擬制成仿草包曲，對比仿草包曲與對照塊曲的酶活性能、微生物群落結構，再將仿草包曲與對照塊曲進行黃酒發酵驗證，比較所發酵黃酒的理化指標、揮發性與非揮發性風味物質的含量，并借助主成分分析比較和展示兩種生麥曲的發酵性能的異同。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、生小麥購自無錫錫山區米市；對照塊曲、熟麥曲由浙江省紹興市古越龍山黃酒廠提供；黃酒酵母為本研究團隊實驗室菌庫保藏菌株，編號為HJ。

糖化酶：2.78×105U/mL，蘇州宏達制酶有限公司；液化酶：1.40×105U/mL，諾維信(中國)生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇、甲醇、乙腈、氨基酸和有機酸等標品均為色譜純，安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

KC/HWS- 250PY型恒溫恒濕培養箱，上海凱測實驗設備有限公司；UV- 1800型紫外可見光分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜系統，美國Waters科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭，美國Supelco公司；10 mL頂空鉗口樣品瓶，安譜實驗科技股份有限公司；Thermo Fisher TRACE 1300型氣相色譜質譜聯用儀，美國Thermo Fisher科技公司；DF- 101KS型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1仿草包曲制備工藝

仿草包曲制作工藝流程見圖1，本研究使用醫用紗布模擬在傳統草包曲外側包裹使用的稻草，采用紹興市古越龍山黃酒廠生麥曲工藝，制成仿草包曲，其工藝流程見圖1。

圖1 仿草包曲的制作流程Fig.1 Production process of imitated Caobao koji

參考相關文獻[1,4,16-17]，經過預實驗確定發酵溫度與濕度參數，按照表1所述工藝在恒溫恒濕培養箱中進行生麥曲發酵。

表1 仿草包曲制作工藝參數Tab.1 Production process parameters of imitated Caobao koji

1.3.2黃酒的釀造工藝及取樣要點

黃酒發酵模擬實驗參考文獻[18]，并略作改動。設置2個分組，第1組：只添加生麥曲(質量分數占生糯米質量的13.5%)釀酒；第2組：生麥曲(質量分數占生糯米質量的11.7%)與熟麥曲(質量分數占生糯米質量的1.8%)混用釀酒。分別在發酵的24、72、120、168、240、360、480 h取樣，進行理化指標、非揮發性風味物質、揮發性風味物質、雜醇含量等的檢測。

1.3.3黃酒和仿草包曲理化指標測定方法

酒精度、總酸、氨基酸態氮含量的測定參考文獻[19]，還原糖采用二硝基水楊酸法[20]進行測定，液化酶活力的測定參考文獻[21]并略有改動，糖化酶活力與酸性蛋白酶活力的測定參考工業酶制劑通用實驗方法QB/T 1803—1993[22]，并略有改動。

1.3.4黃酒揮發性風味物質測定方法

采用頂空固相微萃取(HS- SPME)結合GC- MS法[13]測定發酵黃酒中的揮發性風味物質含量。

1)樣品前處理。取2 mL黃酒樣品，加入4 mL純水，2.5 g氯化鈉以及10 μL內標溶液(2-辛醇，101.8 mg/L)，于50 ℃下使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭平衡吸附50 min，270 ℃解吸5 min，用于GC- MS測定。

2)定性與定量分析。采用美國國家標準技術研究所(National Institute of Standards and Techno-logy，NIST)質譜數據庫檢索結合標準物質進行定性分析。同時采用SPME方法對外標混合物進行檢測，通過外標法對黃酒中的揮發性風味物質進行全定量，得到各揮發性組分的質量濃度。

1.3.5黃酒中雜醇的測定方法

采用GC- MS法測定發酵黃酒中的雜醇[9]。取3.5 mL黃酒樣品置于15 mL離心管，加入3.5 mL純水，1 mL乙腈，600 μL二氯甲烷，50 μL內標溶液(4-甲基-2-戊醇，16 848 mg/L)，渦旋1 min混勻，5 000 r/min離心5 min，收集底部有機相，過0.22 μm濾膜后，用于GC- MS測定。

1.3.6黃酒非揮發性風味物質測定方法

黃酒中的非揮發性風味物質，主要包括有機酸與氨基酸兩類。本研究參考文獻[11]采用HPLC法測定發酵黃酒中的有機酸；參考文獻[23]采用HPLC法測定發酵黃酒中的游離氨基酸。

1.3.7微生物群落結構分析方法

樣品采用送樣測序的方式由北京諾禾致源科技股份有限公司采用賽默飛NGS Ion S5平臺進行16S rDNA的V3～V4區及內轉錄1區(internal transcribed spacer1, ITS1)高通量測序，每份樣品做3個平行，測序結果經過質控后進行QIIME(quantitative insights into microbial ecology)流程分析，具體方法參考文獻[10]。在99%相似度水平進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)的聚類與生物信息統計分析，將序列信息與Silva(http://www.arb-silva.de/)數據庫進行對比，篩選屬水平相對豐度大于0.1%的微生物屬進行群落結構對比分析，平行結果取均值后作圖。

1.4 數據分析

利用SPSS Statistics 19.0與R(version 3.6.3)語言agricolae包進行ANOVA方差分析與差異顯著性檢驗，采用Origin軟件與SIMCA 14.1進行圖像處理與主成分分析(principal component analysis，PCA)，采用Graphpadprism 7制作堆積圖與熱圖分析。所有實驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 仿草包曲與對照塊曲的酶活性能比較

參考相關文獻[1,4,16-17]，基于恒溫恒濕通風制曲工藝進行模擬，根據溫度與濕度進行仿草包曲預實驗，最終采用表1所述工藝參數進行仿草包曲的制作。工藝上，仿草包曲采用的是控溫控濕發酵，不論是培養箱制曲還是放大至圓盤制曲，均可實現基于特定指標的工藝控制；時間上，仿草包曲的總發酵時間為6～10 d，較現有傳統曲、機制曲、自動化生麥曲均有一定程度的縮短[8,15,24-25]；感官上，仿草包曲比對照塊曲顏色深，白色菌絲稠壯，有輕微霉味，呈現脆、粉的特征；而對照塊曲呈黃白色，部分位置出現不均勻的棕褐色，碎粉較少，觸感較硬，結構結實。

對仿草包曲與對照塊曲的酶活性能進行測定，結果見表2。從表2可以看出，仿草包曲的含水量以及糖化力、液化力、蛋白酶活力等酶活指標均較對照塊曲高，這可能是由于對照塊曲的干燥時間更久，而仿草包曲的干燥時間較短，因此具有較高的酶活力。在實際生產中，較高的酶活力通常意味著起酵速度快，發酵效率高，酸罐的可能性較小，但也有可能導致前期糖化速度大于發酵產酒精的速度，進而導致酵母的生長抑制[26-27]。

表2 仿草包曲與對照塊曲的酶活性能比較Tab.2 Comparison of enzyme activity of imitated Caobao koji and control block koji

2.2 仿草包曲與對照塊曲的微生物群落結構對比

圖2 仿草包曲與對照塊曲的細菌與真菌屬水平群落結構Fig.2 Genus level community structure of bacteria and fungi of imitated Caobao koji and control block koji

仿草包曲及對照塊曲的群落結構比較結果見圖2。仿草包曲的細菌群落與對照塊曲相似度較高，糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)作為主要細菌屬，分別占82.4%和76.3%，對照塊曲中含有總計相對豐度13.9%的葡萄球菌屬(Staphylococcus)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等未在仿草包曲中檢測到的細菌屬，而仿草包曲中不可培養的假諾卡氏菌科(unculturedPseudonocardiaceae)的相對豐度比對照塊曲高10.9%；真菌群落結構上二者種類差異較小，但不同屬真菌相對豐度差異較大，尤其是仿草包曲中根毛霉屬(Rhizomucor)高達56.8%，而對照塊曲中曲霉屬(Aspergillus)相對豐度為58.9%，分別是兩種生麥曲中的主要真菌屬。除此以外，其他真菌屬的相對豐度差異較小。這可能是由于仿草包曲培養條件較適宜糖多孢菌屬的生長有關，而真菌群落結構出現較大差異的原因，可能與發酵時間較短有關。據報道，不同發酵階段的生麥曲群落結構顯著不同，根毛霉屬普遍出現在發酵中期，而曲霉屬通常在發酵末期及儲存較長時間后占據較多比例[10，28-30]。

2.3 仿草包曲與對照塊曲發酵黃酒的理化指標對比

圖3 不同曲種制備的黃酒發酵過程中酒精度變化Fig.3 Changes of alcohol content of Huangjiu during fermentation by different kinds of koji

將仿草包曲與對照塊曲進行黃酒釀造實驗，酒精度、還原糖、總酸及氨基態氮的變化情況見圖3至圖5。從圖3可以看出，混有熟麥曲的發酵組發酵啟動迅速，酒精度增長快于只有生麥曲的組，前酵結束時的酒精度分別達到13.9%、14.8%、14.8%、15.0%，后酵結束時均達到15%以上，這說明4組樣品均發酵正常，而仿草包曲在沒有熟麥曲存在的條件下仍然能達到較好的發酵水平，其糖化力雖然較熟麥曲低[31]，但仍能達到一個較好的發酵結果。

還原糖含量是反映酵母利用糖酵解途徑產酒精能力的關鍵指標之一[32]。從圖4還原糖含量變化情況來看，24 h時添加熟麥曲的實驗組還原糖消耗量比只用生麥曲的實驗組平均多26.20 g/L，這說明添加熟麥曲的2組發酵醪液中還原糖消耗速度均高于只用生麥曲組；但隨著發酵進程的進行，在120 h時各組還原糖含量已經接近，這說明在只有生麥曲作為發酵劑的情況下，發酵啟動雖慢，但前酵過程足以使醪液中的還原糖消耗至較低水平。

圖4 不同曲種制備的黃酒發酵過程中還原糖含量變化Fig.4 Changes of reducing sugar content of Huangjiu during fermentation by different kinds of koji

圖5 不同曲種制備的黃酒發酵過程中總酸與氨基氮含量變化Fig.5 Changes of total acid and amino nitrogen contents of Huangjiu during fermentation by different kinds of koji

“無酸不成味”，酸類化合物是黃酒中重要的呈味物質與風味前體，其與氨基酸態氮常一起作為發酵程度的判斷指標[33]。由圖5(a)可知，除對照塊曲組的總酸在前酵期間(0～120 h)低于其他三組外，后酵期間(>120 h)各組總酸含量差異不顯著(P>0.05)，對照塊曲加熟麥曲組總酸稍高于其他三組；而圖5(b)氨基氮含量變化則反映出只有生麥曲組與添加熟麥曲組可顯著分為兩類(P<0.05)，而仿草包曲的發酵樣品在氨基態氮含量上與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。

2.4 仿草包曲與對照塊曲發酵黃酒的揮發性風味物質與雜醇對比

作為黃酒主要微生物來源的生麥曲被認為是黃酒風味的重要來源，因此對發酵黃酒風味物質的檢測，也是反映生麥曲發酵性能的主要方法之一[34]。

對后酵結束后的樣品進行揮發性風味物質與雜醇的檢測，共檢測出7種醇類、5種醛類、4種酸類、15種酯類及3種酚類，其含量見表3。由表3可知，對照塊曲組黃酒的醇類物質含量高于仿草包曲組，4組黃酒的醛類與酸類物質含量接近，但仿草包曲組的酯類物質顯著高于對照塊曲組(P<0.05)，且仿草包曲加熟麥曲組高于對照塊曲加熟麥曲組；4-乙烯基愈創木酚是四組黃酒共有的一種主要酚類物質，黃酒中的酚類物質主要來源于麥曲，這說明仿草包曲與對照塊曲在釀酒的風味指標方面也具有較高的相似性[35-37]。

酯類物質是黃酒中主要的芳香物質，是形成酒體香氣濃郁的主要因素。兩種生麥曲發酵的黃酒中含量較高的酯類物質主要是乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等，酯類物質占所檢測的總揮發性風味物質比重超過17.84%。酯類物質中，乙酸乙酯的含量最高達到(100.37±3.78)mg/L，乳酸乙酯最高為(36.58±4.97)mg/L，均出現在仿草包曲所發酵的黃酒樣品中，這說明仿草包曲較對照塊曲有較高的產酯能力。仿草包曲發酵的黃酒中總醇類物質與總酯類物質含量較對照塊曲分別高51.06 mg/L與18.27 mg/ L，醛類物質與酚類物質等含量較為接近。雜醇是黃酒中引起上頭深醉的主要原因之一[38]，因此雜醇的含量也被認為是黃酒舒適度與發酵性能的重要依據[27，39]。從表3可以看出，仿草包曲組黃酒總雜醇含量較對照塊曲組低21.27 mg/L，這表明仿草包曲工藝具有廣闊的應用前景?？偟膩碚f，仿草包曲所釀制的黃酒具有高酯低雜醇的特點，醇類與酸類物質則沒有顯著差異(P>0.05)，這說明仿草包曲與對照塊曲具有相近的產風味物質能力。

2.5 仿草包曲與對照塊曲發酵黃酒的非揮發性風味物質對比

黃酒中的非揮發性風味物質，主要包括有機酸與氨基酸兩類。圖6是兩種生麥曲發酵黃酒的有機酸含量及組成。由圖6可知，仿草包曲的產酸能力較對照塊曲低，尤其是在乙酸與乳酸含量上顯著低于對照塊曲組(P<0.05)，但在表3中仿草包曲組與對照塊曲組黃酒中乳酸乙酯與乳酸乙酯的含量沒有較大差異，這可能與對照塊曲中乳酸菌屬等主要產酸菌的相對豐度顯著高于仿草包曲有關。

氨基酸是黃酒中重要的呈味物質，不僅賦予黃酒獨特的色澤，高含量的游離氨基酸還是黃酒的健康屬性的體現[40]。經過檢測可知，仿草包曲加熟麥曲組所釀黃酒中谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸的含量分別比對照塊曲組多257.56、220.24、260.34 mg/L，總游離氨基酸含量較對照塊曲加熟麥曲組多2 435.13 mg/L，達到10.63 g/L，是對照塊曲加熟麥曲組的1.30倍，這與前文所述仿草包曲具有較高的酸性蛋白酶活力相一致。圖7是兩種生麥曲發酵黃酒的游離氨基酸含量熱圖。由圖7可以看出，不論添加熟麥曲與否，仿草包曲與對照塊曲所釀黃酒中的游離氨基酸含量均較為接近。

圖6 不同曲種制備黃酒的有機酸組成與含量Fig.6 Organic acid composition and content of Huangjiu fermented by different kinds of koij

圖7 不同曲種制備黃酒的游離氨基酸含量熱圖Fig.7 Heat map of free amino acid content of Huangjiu fermented by different kinds of koji

2.6 基于風味物質的PCA分析

對揮發性風味物質與非揮發性物質數據進行標準化處理后，對4組樣品進行PCA聚類分析，結果見圖8。提取3個主成分，其組合解釋率達71.6%，其中PC1可以解釋46.7%的總體情況。從圖8可以看出，在第一主成分上，只用生麥曲和生、熟麥曲混用所發酵的黃酒各自聚在一起，說明仿草包曲與對照塊曲的發酵性能接近，熟麥曲的添加是影響黃酒品質的主要原因；而在PC2上仿草包曲組與對照塊曲組重合較多，說明仿草包曲在應用過程中與對照塊曲具有一定的相似性，但熟麥曲的使用則是擴大仿草包曲與對照塊曲黃酒風味差異的重要原因。

圖8 基于兩種生麥曲發酵黃酒的風味物質的PCA聚類圖Fig.8 PCA diagram based on flavor substances of Huangjiu fermented by two kinds of raw wheat koji

3 結 論

本研究對仿草包曲與對照塊曲分別進行發酵黃酒的理化指標與風味物質對比。結果表明：從酶活性能來看，仿草包曲的3種酶活性均顯著高于機械塊曲(P<0.05)；從微生物群落結構來看，仿草包曲細菌群落結構與對照塊曲相似度較高，但根毛霉屬與曲霉屬的相對豐度差異較大；從發酵情況來看，仿草包曲所發酵的黃酒酒精度上升趨勢與對照塊曲一致，還原糖、總酸與氨基氮的變化也具有相同的趨勢；從揮發性風味物質來看，仿草包曲發酵的黃酒中總醇類物質與總酯類物質含量較對照塊曲分別高51.06 mg/L與18.27 mg/L，醛類物質與酚類物質等含量較為接近；從非揮發性風味物質來看，仿草包曲組的有機酸總量顯著低于對照塊曲組，而氨基酸總量顯著高于對照塊曲組(P<0.05)。PCA結果表明，仿草包曲與對照塊曲的發酵性能與風味組成較為接近，聚類情況較好，但熟麥曲的添加是造成兩種曲發酵黃酒風味顯著差異的主要原因仿草包曲低酸高酯的發酵特征則表明其可用于發酵清爽型或特型黃酒，此外，仿草包曲在白酒、紅曲黃酒、香醋、醬油的發酵過程中也具有優異的應用潛力。

總的來說，仿草包曲具有與機制塊曲相當的發酵性能。本研究著重于分析仿草包曲在黃酒發酵中的應用與風味評價，在微生物群落結構方面的研究還不夠深入，后續還可從微生物與風味的相關性等方面進行生麥曲與黃酒質量的相關研究，或從原料、工藝、機理解析等角度著手研究生麥曲的智能化制造的潛能，為制曲工藝優化與現代制曲方法提供借鑒。