改性處理對豌豆蛋白結構和功能特性的影響

夏軒澤， 李 言， 錢海峰， 張 暉， 王 立

(江南大學 食品學院， 江蘇 無錫 214122)

碗豆是一種重要的豆科作物，全球年產量約為1 350萬t，目前在90多個國家種植[1]。豌豆中的蛋白質由于其高營養價值、低成本、低致敏性和非轉基因狀態，而被認為是食品行業中一種新興的植物蛋白資源[2]。豌豆蛋白的氨基酸組成相對較為均衡，該蛋白中賴氨酸含量較谷物蛋白更高，但含硫氨基酸的含量相對較低[3]。豌豆蛋白在加工過程中受熱容易變性，從而導致其溶解性變差，且天然豌豆蛋白乳化性和起泡性較差[4]，使其在食品工業中的應用受到限制。

目前物理、化學、酶法或協同處理等改性方式是解決蛋白應用受限問題的常見技術手段，其作用機理是通過改變豌豆蛋白的內在結構從而改善其功能特性。Peng等[5]發現，豌豆蛋白經95 ℃熱處理30 min，其亞基會通過二硫鍵連接成聚集體，促使其表面疏水性增加，O/W界面張力降低，從而改善其乳化活性和乳化穩定性。Liu等[6]研究了磷酸化改性對豌豆蛋白理化特性的影響，發現磷酸化豌豆蛋白的α-螺旋和β-折疊含量增加，β-轉角和無規卷曲含量減少，溶解度提高171.21%，持油性增加73.31%，乳化活性增加63.07%，乳化穩定性增加69.08%，起泡性增加114.28%。Zhou等[7]發現，豌豆蛋白經木瓜蛋白酶酶促共擠處理后，水解更充分，并且提高了溶解性和DPPH自由基清除能力。目前有研究發現，幾種改性方法協同使用對豌豆蛋白功能特性提升的效果較好，且可以減少單一方法改性的缺陷。研究表明，擠壓處理作為一種物理方式，可以通過熱量、壓力和剪切力使蛋白展開、聚集再重新排列[8]；磷酸化處理作為一種化學改性，則可以引入帶負電的磷酸基團，增強蛋白間的靜電排斥力，改變蛋白空間結構。擠壓處理、磷酸化處理這兩種改性方式單獨使用均對蛋白結構影響顯著，然而目前有關使用擠壓和磷酸化協同處理改性豌豆蛋白的研究鮮有報道。

本實驗采用擠壓處理、磷酸化處理、擠壓協同磷酸化處理三種改性方式對豌豆蛋白進行改性，利用傅里葉變換紅外光譜、十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)、蛋白游離巰基及二硫鍵含量測定等分析手段研究改性處理對蛋白結構的影響，以期改善豌豆蛋白的功能特性，擴大其應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白[堿溶酸沉法提取，蛋白質量分數為(89.80±0.20)%]，西安千葉草生物科技有限公司；三聚磷酸鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍R- 250、溴酚藍、二硫蘇糖醇(DTT)、冰乙酸、鹽酸等化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

POLYLAB型雙螺桿擠出擠壓系統(喂料速度為1～50 kg/h，螺桿長徑比≥20∶1，直徑為19～26 mm)，美國賽默飛世爾科技公司；HXLG- 18- 50B普通型真空冷凍干燥機，浙江賽德儀器設備有限公司；F- 7000型熒光光譜儀，日本日立公司；Antaris II型傅里葉變換近紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國)公司；EPS- 300型SDS- PAGE電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1豌豆蛋白的改性處理

1.3.1.1 擠壓處理

經前期優化實驗，將豌豆蛋白擠壓改性的工藝條件確定為：調整水分質量分數至35%，經60、80、95、105 ℃升溫程序，在喂料速度為10 kg/h，螺桿轉速為300 r/min條件下擠出，再將擠出物置于40 ℃恒溫烘箱中平衡水分至質量分數為10%以下，冷卻至室溫，粉碎后過80目篩，儲藏備用。

1.3.1.2 磷酸化處理

經前期優化實驗，將豌豆蛋白磷酸化改性的工藝條件確定為：豌豆蛋白體積分數3%、三聚磷酸鈉體積分數2%、pH值 8.0、反應時間3.5 h、溫度30 ℃，4 ℃透析72 h。將磷酸化改性后的豌豆蛋白真空冷凍干燥，粉碎后過80目篩，儲藏備用。

1.3.1.3 擠壓協同磷酸化處理

將擠壓預處理的豌豆蛋白進行磷酸化處理，擠壓和磷酸化處理條件分別同1.3.1.1和1.3.1.2。協同處理后樣品經過真空冷凍干燥，粉碎后過80目篩，儲藏備用。

1.3.2紅外光譜分析

用紅外光譜儀對樣品進行全波段掃描(400～4 000 cm-1)，掃描次數32次，分辨率為4 cm-1。取1 600～1 700 cm-1的紅外光譜，用Peakfit 4.12軟件進行擬合，根據各子峰的面積計算二級結構含量。

1.3.3游離巰基與二硫鍵的測定

總巰基含量測定參考劉靜媛[9]的方法并稍做修改。制備溶液：將1 mmol/L EDTA，10 mmol/L巰基乙醇，8 mol/L尿素溶于0.1 mol/L pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液(溶液A)。將豌豆蛋白樣品溶解于溶液A，振蕩混勻30 min，6 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液加入0.1 mL Ellman試劑溶液，混合均勻后室溫避光放置15 min，在412 nm處測定上清液與空白對照的吸光度值。

游離巰基測定依據Si等[10]的方法并稍作修改。制備溶液：將1.2 g/L EDTA，6.9 g/L甘氨酸，10.4 g/L Tris溶于0.1 mol/L pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液(記為TGE)，將25 g/L SDS溶解于TGE中(記為SDS- TGE)。將豌豆蛋白樣品溶解在SDS- TGE中，振蕩混勻30 min，6 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液加入0.1 mL Ellman試劑溶液，混合均勻后室溫避光放置15 min，在412 nm處測定上清液與空白對照的吸光度值。總巰基和游離巰基含量的計算方法見式(1)，二硫鍵含量的計算方法見式(2)。

(1)

(2)

式(1)、(2)中：總硫基含量/游離巰基含量，μmol/g；二硫鍵含量，μmol/g。73.53為Ellmann試劑的摩爾吸光系數；A412為樣品在412 nm下的吸光度；D為樣品的稀釋倍數；C為樣品溶液蛋白質量濃度，mg/mL。

1.3.4SDS-PAGE分析

參考Fang等[11]的方法并稍作改動。分離膠和濃縮膠質量分數分別為12.5%、5.0%，上樣量為10 μL，樣品質量濃度為2 mg/mL，電泳儀電壓設置為80 V，待樣品離開濃縮膠后調高電壓至120 V，待條帶跑至凝膠底端時結束電泳。用質量濃度為1 mg/mL的考馬斯亮藍R- 250染色30 min，然后用脫色液反復漂洗，直到蛋白條帶清晰。

1.3.5表面疏水性的測定

采用Yang等[12]的方法并稍作改動。稱取一定量豌豆蛋白溶于0.1 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液，將蛋白溶液稀釋至0.025～0.200 mg/mL。取4 mL蛋白溶液加入20 μL 8 mmol/L的8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)溶液，避光10 min后測定樣品熒光強度。熒光光譜的激發波長為390 nm，發射波長為470 nm，狹縫寬度為5 nm，電壓為700 mV。以相對熒光強度對蛋白質濃度繪圖，將其初始階段的斜率作為蛋白質的表面疏水性指數。

1.3.6溶解度的測定

通過氮溶解指數(NSI)來表示蛋白的溶解度。準確稱取100 mg豌豆蛋白，溶于10 mL 0.1 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌3 h，室溫下8 000 r/min離心20 min，取上清液。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定上清液蛋白含量，凱氏定氮法測定總蛋白含量。根據式(3)計算蛋白溶解度。

(3)

1.3.7持水性以及持油性的測定

參考伍圣文等[13]的方法并稍加修改。準確稱取0.1 g豌豆蛋白于5 mL離心管中，加入1 mL去離子水或大豆油，渦旋振蕩器中振蕩混勻30 min，結束后靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，除去上層液體，準確稱量離心管和沉淀的質量。蛋白的持水性及持油性按式(4)計算。

(4)

式(4)中：m0為稱取樣品的質量，g；m1為樣品加離心管的質量，g；m2為離心后離心管加沉淀的質量，g。

1.3.8乳化活性以及乳化穩定性的測定

參考Wang等[14]的方法測定蛋白的乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)。采用0.1 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液制備16 mL質量分數為0.1%的豌豆蛋白溶液，加入4 mL大豆油，使用高速剪切機在15 000 r/min下剪切2 min，每隔30 s停頓10 s。隨即從距燒杯底部5 mm處吸取50 μL的乳狀液，并加入5 mL的質量分數為0.1% SDS溶液，兩者漩渦混合后于500 nm處測定吸光值A0，0.1% SDS溶液作空白對照。乳液靜置30 min后從距燒杯底部5 mm處重新取樣，按A0的測定步驟測得吸光值A30。EAI和ESI的計算方法如式(5)、(6)。

(5)

(6)

式(5)、(6)中：EAI，m2/g；ESI，min；A0為0 min時測定的吸光值；N是稀釋倍數；C是乳液形成前蛋白溶液中蛋白質量濃度，g/mL；φ是乳液中油的體積分數，%；A30為30 min時測定的吸光值。

1.4 統計分析

每組實驗做3次平行，采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行顯著性分析(P<0.05)，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同改性處理對豌豆蛋白結構變化的影響

2.1.1對二級結構含量的影響

表1為不同改性處理的豌豆蛋白二級結構含量變化情況。從表1可以看出，改性后的豌豆蛋白β-折疊含量顯著提高(P<0.05)，經擠壓處理、磷酸化處理、擠壓協同磷酸化處理后分別提高了10.15%、11.49%、15.06%；β-轉角含量則顯著降低(P<0.05)，分別降低了5.74%、6.88%、9.85%。這是因為擠壓處理的高溫高壓作用，造成蛋白質熱聚集，使其二級結構趨向于從β-轉角轉變形成β-折疊，這與Zhou等[15]闡述的結果一致；磷酸化處理由于在豌豆蛋白部分氨基酸側鏈接了磷酸根，使得二級結構發生變化，蛋白由球狀結構轉變成片層狀結構[16]。

表1 不同改性處理的豌豆蛋白二級結構的含量Tab.1 Content of secondary structure of pea protein with different modification methods %

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同改性處理豌豆蛋白的游離巰基和二硫鍵含量變化Fig.1 Change of free sulfhydryl and disulfide bond content of pea protein with different modification methods

圖2 不同改性處理豌豆蛋白的SDS- PAGE分析Fig.2 SDS- PAGE analysis of pea protein with different modification methods

2.1.2對游離巰基與二硫鍵含量的影響

圖1為不同改性處理對豌豆蛋白游離巰基和二硫鍵含量影響的分析結果。與PPI相比，EPPI、PPPI、EPPPI的游離巰基含量均顯著降低(P<0.05)，而二硫鍵含量顯著增加(P<0.05)。游離巰基含量的下降主要是由于二硫鍵的形成和蛋白分子聚集包埋巰基。改性豌豆蛋白二硫鍵含量與游離巰基的含量變化趨勢相反，這表明擠壓處理和磷酸化處理均可使豌豆蛋白分子之間通過游離巰基形成二硫鍵，蛋白交聯形成可溶性或不可溶性蛋白聚集體，這與Zhang等[17]、于麗娜等[18]的報道類似。

2.1.3對亞基組成的影響

圖2為不同改性處理豌豆蛋白的SDS- PAGE分析結果。非還原電泳主要反映豌豆蛋白中各種蛋白的組成，還原電泳主要反映豌豆蛋白中各種亞基的組成，此時大部分聚集體解聚，11s蛋白(豆球蛋白AB)二硫鍵被破壞，轉變成豆球蛋白A和豆球蛋白B兩個亞基[19]。圖3為非還原電泳條件下，不同改性處理豌豆蛋白的豆球蛋白A、豆球蛋白B的相對表達。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖3 非還原電泳條件下不同改性處理豌豆蛋白的 豆球蛋白A、豆球蛋白B的相對表達Fig.3 Relative protein expressions of legumin A and legumin B of pea protein with different modification methods under non-reducing electrophoresis conditions

由圖2、圖3可知，在非還原電泳條件下，豆球蛋白A的含量按改性處理方式排序為PPI>PPPI>EPPI>EPPPI，豆球蛋白B的含量按改性處理方式排序為PPI>EPPI>EPPPI>PPPI。改性處理后，豆球蛋白A和豆球蛋白B含量減少，根據測定的二硫鍵含量變化結果，改性處理后豆球蛋白A和豆球蛋白B亞基可能通過二硫鍵與其他亞基交聯；EPPI的豆球蛋白AB含量大于PPI，表明擠壓處理促進豆球蛋白A和豆球蛋白B亞基通過二硫鍵形成豆球蛋白AB，這與2.1.2中擠壓處理后二硫鍵含量增加結果對應。圖2(b)中，在還原電泳條件下，分離膠頂端仍有部分顏色較淺的條帶，這說明仍有部分聚集體未解聚，即構成聚集體的不只有二硫鍵和疏水鍵。豆球蛋白A的含量按改性處理方式排序為PPI>PPPI>EPPPI>EPPI，豆球蛋白B的含量按改性處理方式排序為PPI>PPPI>EPPPI>EPPI。未改性豌豆蛋白的豆球蛋白A和豆球蛋白B含量仍高于改性豌豆蛋白，說明改性處理后部分豆球蛋白A、豆球蛋白B不止通過二硫鍵形成聚集體，仍有部分化學鍵未被破壞。EPPI、EPPPI的豆球蛋白A和豆球蛋白B含量明顯低于PPI、PPPI，表明擠壓處理對豆球蛋白的影響較磷酸化處理明顯；EPPI與EPPPI的條帶差別較小，表明磷酸化處理對經擠壓預處理的豌豆蛋白亞基影響較小。

2.2 不同改性處理對豌豆蛋白功能特性的影響

2.2.1對表面疏水性的影響

不同改性處理對豌豆蛋白表面疏水性影響的分析結果見圖4。表面疏水性與蛋白質分子的展開和聚集狀態有關，其變化可以側面反映蛋白質的三級結構。從圖4可以看出，與未改性豌豆蛋白相比，改性豌豆蛋白的表面疏水性顯著增大(P<0.05)，其中擠壓處理組提高了49.78%，磷酸化處理組提高了23.93%，擠壓協同磷酸化處理組提高了101.95%。這是因為擠壓處理促進二硫鍵形成，更易形成不溶性聚集體，表面疏水性增強；磷酸化處理由于引入帶負電的磷酸根，靜電排斥力增強，引起疏水基團暴露，蛋白分子間疏水相互作用增強。豌豆蛋白經擠壓預處理后可以顯著加強磷酸化處理對豌豆蛋白結構的影響，在兩種改性方式共同作用下，導致原本深埋在蛋白質內部的疏水性基團暴露，增加蛋白表面疏水性。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 不同改性處理豌豆蛋白的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of pea protein with different modification methods

2.2.2對溶解性的影響

不同改性處理的豌豆蛋白的溶解性變化情況見表2。由表2可知，不同改性處理的豌豆蛋白溶解性差異顯著(P<0.05)，其中磷酸化處理、擠壓協同磷酸化處理的豌豆蛋白溶解性可分別提升17.19%、10.38%，而擠壓處理降低了其溶解性，這與Liu等[6]、Banach等[20]的研究結果一致。PPPI、EPPPI溶解性高于PPI的原因可能是磷酸化后接上了極性的磷酸根基團，蛋白的水合作用改善，電負性增加，蛋白分子之間的靜電排斥力提高。EPPI可能是由于擠壓處理，受到高溫高壓、高剪切力作用，疏水基團暴露，疏水相互作用增強，形成不溶性聚集體，從而導致其溶解性顯著降低。

2.2.3對持水性、持油性及乳化性的影響

持水性和持油性決定蛋白質的水/油保持力和不同上標字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

表2 不同改性處理豌豆蛋白的溶解性Tab.2 Solubility analysis of pea protein with different modification methods

蛋白質- 水/油相互作用，并影響食品的質地和質量[21]。圖5為不同改性處理對豌豆蛋白持水性、持油性的變化情況。由圖5可知，磷酸化處理可以顯著改善豌豆蛋白的持水性，而擠壓處理顯著降低豌豆蛋白的持水性，這可能是改性處理影響其溶解性，從而影響持水性；擠壓處理、磷酸化處理以及擠壓協同磷酸化處理均可以顯著提高豌豆蛋白的持油性，這可能是由于改性處理增強了豌豆蛋白的表面疏水性。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖5 不同改性處理豌豆蛋白的持水性及持油性變化Fig.5 Change of water holding capacity and oil holding capacity of pea protein with different modification methods

不同改性處理豌豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性變化情況見圖6。由圖6可知，與未改性組相比，3種改性處理均顯著(P<0.05)提高了豌豆蛋白的乳化活性、乳化穩定性。擠壓處理由于高溫高壓、高剪切作用，蛋白展開、聚集、再重新排列，蛋白結構變化顯著，親水性基團分布位點改變，親油性疏水基團暴露，表面疏水性增強，從而改善乳化能力；磷酸化處理改善了豌豆蛋白的乳化活性、乳化穩定性的原因是引入親水性磷酸基團，蛋白分子的溶解性和分散性改善，且帶負電的磷酸根使得乳液液滴之間存在靜電排斥力，乳液液滴間的絮凝和聚集的現象明顯改善；擠壓協同磷酸化處理既增強了豌豆蛋白的表面疏水性，又改善了其溶解性，增加了靜電排斥力，改善了其親水性和親油性，利于形成油水界面膜，從而改善了豌豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖6 不同改性處理豌豆蛋白的乳化活性及乳化穩定性Fig.6 Emulsifying activity and emulsifying stability of pea protein with different modification methods

3 結 論

擠壓處理、磷酸化處理、擠壓協同磷酸化處理均有效改變了豌豆蛋白的結構特性和功能特性，綜合對比，擠壓協同磷酸化處理對豌豆蛋白理化性質影響更為明顯。對3種改性豌豆蛋白通過紅外光譜、SDS- PAGE等蛋白質結構分析發現，豌豆蛋白二級結構改變，β-折疊含量增加，β-轉角含量減少；游離巰基含量減少，二硫鍵含量增加；亞基組成改變，豆球蛋白A和豆球蛋白B含量減少；表面疏水性增加。對3種改性豌豆蛋白的功能特性分析結果表明，磷酸化處理、擠壓協同磷酸化處理能夠改善豌豆蛋白的溶解性，而擠壓處理降低了其溶解性；3種改性處理后的豌豆蛋白持油性、乳化活性及乳化穩定性改善，但在這些功能特性上，單一的擠壓處理、磷酸化處理改善效果不如擠壓協同磷酸化處理。本研究表明，擠壓協同磷酸化處理能夠改善豌豆蛋白的加工特性，提高豌豆蛋白產品的附加價值，進而擴大豌豆蛋白在食品工業中的應用范圍。