聚酰胺用于選擇性激光燒結3D打印截骨導板的性能研究

項巍巍，黃野，劉國彬，柳劍，張名俊，王卿，雷鵬坤，王郁琪，王小龍，萬翔*

[(1.強生(蘇州)醫療器材有限公司，江蘇 蘇州 215126；2.北京積水潭醫院，北京 100035；3.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050000；4.強生(上海)醫療器材有限公司，上海 200030)]

聚酰胺材料通過選擇性激光燒結技術加工成型，是3D打印截骨導板常用的一種加工方式。3D打印截骨導板在手術中起定位、導向和保護的作用，會與骨表面直接接觸。導板設計需要與手術部位相匹配，滿足力學性能的要求[6]。應使用具有一定硬度、韌性、受力后不易變形的材質[7]，且在使用前需要對導板進行滅菌，制造導板的材料應生物相容性檢測合格。

然而，目前針對3D打印截骨導板及其材料的相關標準尚不完善，關于3D打印截骨導板的材料要求也不明確。因此，本文針對目前廣泛應用于醫療3D打印的聚酰胺材料進行了機械性能、化學性能、生物學相容性的研究。

1 資料與方法

1.1 試驗用材料和儀器

1.1.1 機械性能測試 測試樣品為強生(蘇州)醫療器材有限公司使用EOS P110 3D打印機，由高分子聚酰胺材料打印，再經132℃、4 min高壓蒸汽滅菌的截骨導板。參考國家標準設置拉伸性能測試(包括斷裂延伸率、拉伸模量和抗拉強度)、維卡軟化溫度測定、負荷變形溫度測試和滾動磨損實驗。拉伸性能測試設置30個試樣，狗骨狀試件寬度(10.0±0.2)mm，厚度(4.0±0.2)mm，初始夾具間距(115.0±1.0)mm。維卡軟化溫度測定實驗設置15個試樣，為厚3.0～6.5 mm，邊長10 mm的正方形。負荷變形溫度測試設置15個試樣，橫截面為矩形，長度為80 mm，寬度為10 mm，厚度為4 mm的樣條。滾動磨損實驗設置6個試樣，為直徑100 mm的圓形。

1.1.2 化學性能測試 按樣品質量0.2 g加1 mL的比例加水，在(37±1)℃放置24 h，分離液體，冷至室溫，作為檢驗液。

儀器：電子天平(AL104，梅特勒-托利多，中國)，pH計(310p-01A，奧力龍，中國)，電熱恒溫干燥箱(DHG-9147A，上海精宏，中國)，紫外可見分光光度計(Cary，Agilent Technologies，德國)。

該項目中所使用的是電阻應變式稱重傳感器，該傳感器由金屬應變彈性本體、套筒和與其相連的電阻應變片構成，結構如圖1所示。

試劑：硫代硫酸鈉(永華化學科技)，pH緩沖溶液(Thermo)。高錳酸鉀，硫酸，碘化鉀，淀粉，乙酸胺，鹽酸，硫代乙酰胺，硝酸鉛，氫氧化鈉，丙三醇(甘油)，硝酸。以上試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 生物相容性評估試驗

1.1.3.1 細胞毒性試驗 將樣品和浸提液[10%胎牛血清的低限基本(minimum essential medium，MEM)]培養液按照樣品表面積與浸提液比為3 cm2/mL置于37℃恒溫浸提24 h備用。小鼠成纖維細胞L929(來自美國菌種保存中心)。儀器：高壓滅菌器(YXQ-LS-50，上海博迅，中國)，倒置顯微鏡(CKX31，OLYMPUS，日本)，酶聯免疫檢測儀(PowerWave XS2，BIO-TEK，美國)。試劑：噻唑蘭[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-Diphenyltetrazolium Bromide，MTT](SIGMA)、胎牛血清(CORNING)、胰酶(GiBco)。

1.1.3.2 皮膚致敏試驗 動物采用哈特蘭豚鼠30只[蘇州鎮湖實驗動物科技有限公司，SCXK(蘇)2015-0007]，體重300～500 g，雄性。儀器：臥式大容量恒溫振蕩器(SPH-111B，上海世平實驗設備，中國)，壓力蒸汽滅菌器(LMQC-50E，山東新華，中國)。試劑：0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司)；芝麻油(吉安市綠源天然香料油提煉廠)；2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)(Xiya Reagent)；弗氏完全佐劑(SIGMA)。陽性對照組：溶劑為0.9%氯化鈉(Sodium chloride，SC)注射液或芝麻油(Sesame oil，SO)，誘導濃度為0.5% DNCB，激發濃度為0.1% DNCB；陰性對照組：0.9%氯化鈉注射液；芝麻油。供試液：用0.9%氯化鈉注射液或芝麻油作為浸提液，浸提比例為3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h內用于測試。

1.1.3.3 皮內反應試驗 主要儀器同1.1.3.2新西蘭白色純種大白兔3只[蘇州鎮湖實驗動物科技有限公司，SCXK(蘇)2015-0007]，雌性，體重不低于2kg。試劑：0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司)；芝麻油(吉安市綠源天然香料油提煉廠)；十二烷基硫酸鈉(Solarbio)。陰性對照液：極性對照為0.9%氯化鈉注射液，非極性對照為芝麻油。陽性對照液：極性對照為20%十二烷基硫酸鈉溶于0.9%氯化鈉注射液；非極性對照為20%十二烷基硫酸鈉溶于芝麻油。供試液：使用0.9%氯化鈉注射液或芝麻油作為浸提液，浸提比例為3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h內用于測試。

1.2 試驗方法

1.2.1 機械性能測試 拉伸試驗參考GB/T 1040.1-2006塑料拉伸性能的測試。實驗室環境條件為(23±2)℃。利用夾具將試件兩端夾緊后，使試驗機以50 mm/min的速度加載，直至試件斷裂。維卡軟化溫度測試參考GB/T 1633-2000熱塑性塑料維卡軟化溫度的測定。受試材料的維卡軟化溫度為試樣維卡軟化溫度的算數平均值。負荷變形溫度測試參考GB/T 1634.1-2004塑料負荷變形溫度的測定。以(120±10)℃/h的均勻速率升高熱浴的溫度，記下樣條初始撓度凈增加量達到標準撓度時的溫度，即為在GB/T 1634有關部分規定的彎曲應力下的負荷變形溫度。受試材料的負荷變形溫度為試樣負荷變形溫度的算數平均值。滾動磨損試驗參考GB/T 5478-2008塑料滾動磨損試驗方法。

1.2.2 化學性能測試 參考GB/T14233.1-2008醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法，第一部分第5章節檢驗液溶出物分析方法中的5.2、5.4、5.5、5.6、5.7，分別測定檢驗液的還原物質、酸堿度、蒸發殘渣、重金屬總量和紫外吸光度。

1.2.3 生物相容性評估試驗 根據GB/T16886.1-2011醫療器械分類，3D打印骨科導板屬于外部接入器械，接觸時間為A類短期接觸，即在24 h以內1次、多次或重復使用或接觸的器械。因此該生物相容性評估試驗包括細胞毒性、皮膚致敏及皮內反應。

參照細胞毒性測試-體外法GB/T 16886.5-2017標準執行。將浸提液按照100%、75%、50%、25%的濃度用培養液稀釋，陽性對照樣品為1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅的10%胎牛血清MEM溶液，浸提液濃度為0作為陰性對照組，空白對照樣品為浸提液。每組做5個平行樣。

將處于對數生長期的L929細胞制備成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/mL。接種上述細胞懸液到96孔板中，每孔100 μL，37℃，5% CO2，>90%濕度培養24 h。待細胞長成單層后，吸出原來的培養液，分別加入100μL試驗樣品浸提液(100%，75%，50%，25%)、空白對照液、陽性對照液和陰性對照液。每組做5個平行樣。

培養24 h后，取出96孔板先做細胞形態學觀察。然后每孔加50 μL MTT(1 mg/mL)，培養2 h，吸棄上清，加100 μL異丙醇溶解結晶。在酶標儀上以570 nm為主吸收波長，650 nm為參考波長測定吸光度值。

1.2.3.2 皮膚致敏試驗 參照刺激與皮膚致敏試驗GB/T16886.10-2017標準執行。(1)皮內誘導階段。在每只動物去毛的肩胛骨內側部位從頭部向尾部成對進行A、A、B、B、C、C共3對6個點，皮內注射0.1 mL。A：弗氏完全佐劑與選定的溶劑以50∶50(V/V)比例混合的穩定性乳化劑。B：注射試驗樣品(未經稀釋的浸提液)；對照組動物僅注射相應溶劑。C：試驗樣品(部位B中采用的濃度)，以50∶50的體積比例與弗氏完全佐劑與溶劑(50%)配制成的乳化劑混合后進行皮內注射；對照組動物注射對照液與佐劑配置成的乳化劑。(2)局部誘導階段。按B的最大濃度未產生刺激反應，在局部敷貼應用前(24±2)h，試驗區用10%十二烷基硫酸鈉進行預處理。皮內注射后7 d用0.5 mL供試品浸提液浸透覆蓋誘導注射點。采用封閉式包扎帶固定樣品，隨后于(48±2)h后去除。對照組動物使用對照液同法操作。(3)激發階段。于局部誘導后14 d對全部動物進行激發。用0.5 mL供試品浸提液和對照液浸透后的吸收性紗布塊分別局部貼敷于誘導階段未試驗部位，采用封閉式包扎帶固定，隨后于(24±2)h后去除。(4)結果評價。除去樣品后(24±2)h和(48±2)h，在全光譜光線下觀察動物激發部位皮膚情況。按照Magnusson和Kligman分級標準對每一激發部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級。

1.2.3.3 皮內反應試驗 參照刺激與皮膚致敏試驗GB/T16886.10-2017標準執行。將兔背部脊柱兩側的背毛除去，作為試驗觀察的部位。在兔背一側注射0.2 mL樣品SC浸提液和0.2 mL樣品SO浸提液；另一側同樣注射0.2 mL SC陰性對照液和0.2 mL SO陰性對照液。觀察即時、(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h注射局部及周圍皮膚組織反應，記錄包括紅斑、水腫和壞死等情況。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件，對斷裂延伸率、拉伸模量、拉抗強度、維卡軟化溫度、負荷變形溫度和磨損重量損失采用單樣本t檢驗；P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 機械測試結果

2.1.1 分析結果 斷裂延伸率、拉伸模量、抗拉強度、維卡軟化溫度、負荷變形溫度和磨損重量損失的數據樣本均值與總體均值之間比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)[8]。證明表中數據間差異不是由抽樣引起的，即實驗處理有效[9]。

表1 機械性能數據

2.2 化學測試結果 測定檢驗液中的還原物質消耗0.002 mol/L KMnO40.4 mL；檢驗液與空白溶液pH差值為1.4；重金屬總含量(以pb2+計)<1.0 μg/mL；蒸發殘渣為0.6 mg；紫外吸光度為0.008。測試結果符合GB19335-2003中第3章節對以上5項的要求。

2.3 生物相容性試驗結果

2.3.1 細胞毒性試驗結果 接種細胞前和加浸提液前生長狀態良好；加浸提液24 h后，陽性對照組細胞裂解死亡；空白對照組、陰性對照組、樣品浸提液組(100%，75%，50%，25%)生長狀態良好。24 h細胞活力結果見表2。細胞形態觀察和細胞活力的試驗結果顯示樣品浸提液對小鼠成纖維細胞無潛在毒性影響。

表2 24 h細胞活力結果

2.3.2 皮膚致敏試驗結果 實驗組激發后陽性發生率為0；陽性對照組陽性發生率為100%，陰性對照組發生率為0。實驗組和陰性對照組豚鼠斑貼部位皮膚未出現紅斑和水腫；陽性對照組斑貼部位皮膚出現明顯紅斑和水腫。豚鼠皮膚致敏試驗中未見樣品浸提液對豚鼠引起皮膚致敏反應。

2.3.3 皮內刺激試驗結果 實驗過程中動物未出現異常癥狀或死亡。試驗樣品組極性和非極性浸提液皮內反應均未超過對照組。樣品的極性和非極性浸提液在兔皮膚內未發現皮內刺激反應。

3 討 論

隨著我國人口老齡化，骨關節炎多發，骨科臨床醫師對保膝治療展現了極大的積極性[10]。近年來基于脛骨高位內側截骨術的保膝手術被證明是治療早期骨關節炎的有效手段。然而此類手術需要一定的學習曲線，術中需要借助醫者的經驗積累，多次透視調整以獲得理想的截骨位置，導致手術時間延長，增加出血量、X線輻射，以及術后并發癥等都會影響手術效果。數字化3D打印技術應用于脛骨高位截骨術領域，可以幫助克服以上缺點，從而使得脛骨高位截骨手術得到更好的應用[11]。

目前已有多種材料用于3D打印導板，例如：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(acrylonitrile butadiene styrene copolymers，ABS)、光敏樹脂、聚酰胺、金屬等[1，12]。ABS樹脂成型的材料韌性好，但精度較低，適用于制備大體積的導板，如脊柱經皮導板[13]；光敏樹脂材料成型精度高，強度適中，在口腔醫學領域應用廣泛[14]；聚酰胺具有成型溫度低、所需激光功率小的優點，而且受力后不易變形，可消毒，適合用于制備小體積并對強度有要求的導板[15]；金屬材料包括鈦合金、醫用不銹鋼、鋁合金等，具有高精度和高強度，可加工成用于引導鉆頭、擺鋸和骨刀的導板[16]。打印材料和增材制造技術的選擇很大程度上取決于預期用途，不同3D打印技術制備的手術導板各有優勢，需根據具體手術方式進行選擇[17]。

通過本研究中所涉及的實驗，可以證明聚酰胺選擇性激光燒結3D打印截骨導板表面硬度大且成型后形變溫度高，正常條件下使用時能保持良好且穩定的機械性能[18]。其化學性能符合國標一次性使用血路產品通用技術條件對相關測試項目的要求。材料無明顯細胞毒性、皮膚致敏和皮內刺激反應，符合國標對于組織或骨短期接觸的外部接入器械的生物安全性的要求。但聚酰胺3D打印截骨導板在臨床應用中仍然存在一些問題，如術中使用擺鋸沿著導板進行操作時的高頻振動容易使導板產生粉碎顆粒，在沿截骨槽進行切割時也有可能使其斷裂[19]。此外由于聚酰胺材料粉末細小且不能被機體吸收，殘留在患者體內是否存在安全隱患還有待臨床長期隨訪研究[20]。

綜上所述，3D打印聚酰胺材料能夠發揮3D打印導板數字化制作高效率的優勢，其機械性能良好，化學性能和生物相容性都符合相關要求，具有良好的臨床應用前景。

感謝蘇州大學環境研究所在3D打印截骨導板性能測試試驗中給予的幫助和指導。