基于芯片篩選肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌差異表達(dá)的環(huán)狀RNA_000585并探討其潛在的作用機(jī)制

易烽明， 辛龍祥， 馮 龍

1 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腫瘤科， 南昌 330006； 2 江西省腫瘤醫(yī)院 內(nèi)科， 南昌 330029

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)為第二常見的肝惡性腫瘤，大多患者在診斷時(shí)已處于腫瘤晚期，無(wú)法行根治性切除[1]。然而，對(duì)于無(wú)法根治性切除的膽管癌患者，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療效果有限，中位總生存率時(shí)間(overall survival，OS)<1年[2]。基于既往文獻(xiàn)，許多危險(xiǎn)因素與膽管癌相關(guān)，但關(guān)于膽管癌的發(fā)病機(jī)制的證據(jù)尚有限[3]。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有組織和發(fā)育特異性RNA，由外顯子和/或內(nèi)含子序列通過(guò)反向剪接產(chǎn)生。circRNA的生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、與線性RNA競(jìng)爭(zhēng)、miRNA海綿、翻譯蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)肽的翻譯等功能[4]。越來(lái)越多的證據(jù)證明circRNA在惡性腫瘤中異常表達(dá)，失調(diào)的circRNA影響許多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖信號(hào)、細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞凋亡和血管生成等，其大多數(shù)是通過(guò)作為miRNA海綿靶向miRNA而發(fā)揮作用。目前已有部分研究探索circRNA在iCCA中的功能，如cirRNA CDR1as在腫瘤組織中高表達(dá)，與TNM分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[5]；circ-SMARCA5與ECOG評(píng)分、TNM分期和CA19-9狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)[6]；部分circRNA還可能與iCCA細(xì)胞系的遷移、侵襲和增殖有關(guān)。體外研究[7]發(fā)現(xiàn)iCCA細(xì)胞系中circRNA CDR1as水平顯著升高，其通過(guò)靶向miR-614促進(jìn)了iCCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；與周圍正常組織相比，iCCA組織中circ_0000284表達(dá)增加，通過(guò)靶向LY6E促進(jìn)iCCA細(xì)胞系的遷移、侵襲和增殖，其也是iCCA的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物[8]。另有研究[9]確定了CIRC2174可能是iCCA的潛在遺傳途徑，其可通過(guò)作為miR-149海綿靶向OCT-2；circ-0000284可促進(jìn)iCCA的進(jìn)展，并可通過(guò)外顯子直接從iCCA細(xì)胞轉(zhuǎn)移到周圍的正常細(xì)胞[10]；circ_0001649過(guò)表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)iCCA細(xì)胞凋亡，從而抑制iCCA細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]；circ_0005230作為miR-1238和miR-1299海綿，可能是治療iCCA的有效靶點(diǎn)[12]。

本研究旨在通過(guò)組織芯片分析，鑒定circRNA在iCCA中的異常表達(dá)，并探討顯著差異表達(dá)的circRNA在iCCA中的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 配對(duì)樣本circRNA芯片檢測(cè)及circRNA_000585定量PCR驗(yàn)證 選取2019年7月—12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的3例iCCA患者，iCCA的診斷基于術(shù)后病理。微陣列雜交芯片遵循參考文獻(xiàn)[13]的方法，分析了3組配對(duì)的iCCA組織標(biāo)本和癌旁組織。兩組間差異表達(dá)的circRNA通過(guò)火山圖分析鑒定。差異表達(dá)的circRNA通過(guò)倍數(shù)差異(FoldChange，F(xiàn)C)過(guò)濾鑒定。通過(guò)t檢驗(yàn)分析是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FC>1.5和P<0.05的circRNA為具有顯著差異表達(dá)。收集同一時(shí)期15例iCCA樣本，選擇并鑒定FC>3和P<0.05的circRNA，通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)15組配對(duì)患者進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)15組配對(duì)患者中iCCA的circRNA_000585顯著上調(diào)。circRNA_000585和內(nèi)參的PCR信息見表1。

表1 circRNA_000585和內(nèi)參PCR信息

1.2 miR-615-5p定量PCR驗(yàn)證 利用TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)軟件對(duì)circRNA/miRNA相互作用進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-615-5p與circRNA_000585相互作用，并通過(guò)RT-PCR鑒定miR-615-5p的表達(dá)。miR-615-5p和內(nèi)參的PCR信息見表2。

表2 miR-615-5p和內(nèi)參PCR信息

1.3 AMOT/YAP定量PCR驗(yàn)證 microRNA/蛋白相互作用是基于miRPathDB軟件。發(fā)現(xiàn)miR-615-5p靶向AMOT，并通過(guò)RT-PCR鑒定AMOT的表達(dá)。結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能分析，發(fā)現(xiàn)AMOT與YAP相互作用，并通過(guò)RT-PCR鑒定YAP的表達(dá)。AMOT/YAP和內(nèi)部參考的PCR信息見表3。

表3 AMOT/YAP和內(nèi)參PCR信息

2 結(jié)果

2.1 iCCA組織和癌旁組織circRNA芯片檢測(cè)結(jié)果 iCCA組織和癌旁組織circRNAs的差異表達(dá)見圖1、2。117個(gè)circRNAs在iCCA中上調(diào)，104個(gè)circRNAs在iCCA中下調(diào)，其中有10個(gè)circRNAs在iCCA組織中3倍上調(diào)于癌旁組織 (circRNA_002172、circRNA_002144、circRNA_001588、circRNA_000166、circRNA_000585、circRNA_000167、circRNA_402608、circRNA_006853、circRNA_001589、circRNA_008882)，3個(gè)circRNAs在iCCA組織中表達(dá)低于癌旁組織的1/3 (circRNA_406083、circRNA_104940、circRNA_006349) (圖3、4)。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)15例iCCA患者的circRNA_000585與配對(duì)癌旁標(biāo)本相比顯著上調(diào)(t=3.607，P=0.003)(圖5)。

2.2 miR-615-5p驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)RT-PCR比較15例配對(duì)患者中miR-615-5p的表達(dá),與癌旁相比，iCCA顯著下調(diào)(t=5.724，P<0.001)(圖6)。

2.3 AMOT/YAP驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)RT-PCR鑒定AMOT/YAP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AMOT在iCCA中的表達(dá)顯著上調(diào)(t=2.664，P=0.019)(圖7)。此外，在iCCA中，YAP顯著上調(diào)(t=2.986，P=0.009 8)(圖8)。

圖1 iCCA與癌旁組織circRNAs表達(dá)的熱圖

注：a，散點(diǎn)圖；b，火山圖。圖2 circRNAs表達(dá)的散點(diǎn)圖和火山圖

圖3 與癌旁組織相比iCCA中上調(diào)的circRNAs

圖4 與癌旁相比iCCA中下調(diào)的circRNAs

圖5 iCCA與癌旁中circRNA_000585的表達(dá)情況

3 討論

circRNA在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用，其中包括作為miRNA海綿、親本基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯等功能。在體液(如血漿、唾液)中高度穩(wěn)定，這個(gè)特點(diǎn)使circRNA成為腫瘤的理想生物標(biāo)志物[14]。circRNA還可通過(guò)腫瘤微環(huán)境影響癌癥的惡性行為從而發(fā)揮作用[15]。

圖6 iCCA與癌旁組織中mir-615-5p的表達(dá)情況

圖7 iCCA與癌旁組織中AMOT的表達(dá)情況

圖8 iCCA與癌旁組織中YAP的表達(dá)情況

本研究試圖探討膽管癌中所有相關(guān)的circRNA，以期望發(fā)現(xiàn)iCCA中circRNA的差異表達(dá)。采用高通量circ-RNA微陣列芯片、生物信息學(xué)分析等方法檢測(cè)了差異表達(dá)的circRNA。最終發(fā)現(xiàn)117個(gè)circRNAs在iCCA中上調(diào)，104個(gè)circRNAs在iCCA中下調(diào)，其中有10個(gè)circ-RNAs在iCCA組織中3倍上調(diào)于癌旁組織，3個(gè)circRNAs在iCCA組織中表達(dá)低于癌旁組織的1/3。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)15例iCCA患者的circRNA_000585與相應(yīng)癌旁標(biāo)本相比顯著上調(diào)。circRNA_00585是iCCA中一種新的circRNA，本研究試圖探討circRNA_000585在iCCA中的潛在作用。

circRNA可通過(guò)circRNA-DNA、circRNA-RNA、circ-RNA-蛋白質(zhì)相互作用而建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA海綿是circRNA最常見的靶分子，circRNA-miRNA-RNA調(diào)控軸與細(xì)胞信號(hào)的多種功能有關(guān)，與腫瘤發(fā)生或生物學(xué)行為相關(guān)[16]。隨后作者基于TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)了circRNA/miRNA相互作用，并將所有差異表達(dá)的circRNA與circRNA/miRNA相互作用信息進(jìn)行了詳細(xì)的注釋。發(fā)現(xiàn)miR-615-5p與circRNA_000585相互作用，并通過(guò)RT-PCR鑒定miR-615-5p的表達(dá)。與癌旁相比，miR-615-5p在iCCA中顯著下調(diào)。miR-615是一種高度保守的miRNA，參與胚胎發(fā)生及生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，還參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移的調(diào)控，充當(dāng)抑癌因子或腫瘤啟動(dòng)子。既往研究[17]表明，miR-615-5p是一種腫瘤抑制因子，可預(yù)防腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究通過(guò)miRPathDB軟件找到miR-615-5p目標(biāo)基因AMOT，同時(shí)STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能分析發(fā)現(xiàn)AMOT和YAP的相互作用。通過(guò)RT-PCR鑒定AMOT/YAP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AMOT在iCCA中與癌旁相比有上調(diào)。此外，YAP在iCCA中顯著上調(diào)。 AMOT為一種細(xì)胞外蛋白，可控制細(xì)胞遷移、緊密連接形成、細(xì)胞極性和血管生成。研究[18-19]表明AMOT參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展以及Hippo-YAP1通路。AMOT可促進(jìn)YAP的核易位，并作為YAP-TEAD復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄輔助因子，以促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的增殖和肝臟的癌癥發(fā)展。AMOT家族成員在大多數(shù)惡性腫瘤中促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲。然而，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和肺癌中，AMOT可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，AMOT對(duì)YAP的調(diào)控，其為促進(jìn)YAP內(nèi)化到細(xì)胞核或保留YAP在細(xì)胞質(zhì)中也存在爭(zhēng)議[20]。YAP被發(fā)現(xiàn)在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和過(guò)度生長(zhǎng)[21]。在體外，YAP在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[22]。YAP還具有其他功能，如誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換[23]。最近的研究[24]表明，YAP/TAZ介導(dǎo)的代謝改變有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。YAP可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)締合域轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)iCCA的腫瘤增殖、血管生成和耐藥[25]。YAP/TAZ的過(guò)度激活可促進(jìn)iCCA的發(fā)展，WWC1和NF2等分子可通過(guò)抑制YAP/TAZ的致癌活性來(lái)抑制iCCA的發(fā)展[26]。

由于本研究納入的患者規(guī)模較小，后續(xù)筆者將收集更多的樣本以證實(shí)結(jié)果。在本研究中涉及的潛在途徑，仍需在體外和體內(nèi)驗(yàn)證，進(jìn)而揭示相關(guān)通路的詳細(xì)機(jī)制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：易烽明、辛龍祥負(fù)責(zé)資料分析和數(shù)據(jù)收集；易烽明、馮龍負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析，文章撰寫，文章修改及定稿。