基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討扶正化瘀方治療肝癌的作用機(jī)制

齊婧姝， 平大冰， 孫 鑫， 薛靜波， 陶艷艷， 彭 淵， 劉成海,,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203；3 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 4 上海中醫(yī)健康服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 上海 201203

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)包括肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌[1]，其病死率居全世界惡性腫瘤第三位[2]，我國每年肝癌死亡人數(shù)占全球肝癌死亡的51%[3]。肝癌往往起病隱匿、進(jìn)展迅速、復(fù)發(fā)快、預(yù)后差[4]，是危害人類健康的重大疾病。因此，對肝癌的防治是臨床研究的重點(diǎn)。

扶正化瘀方(fuzheng huayu，F(xiàn)ZHY)由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子6味藥組成，適用于乙型肝炎肝纖維化屬瘀血阻絡(luò)，肝腎不足證者。本課題組前期工作[5]表明，該方可有效改善肝炎后肝硬化患者肝功能、改善肝組織炎癥，并逆轉(zhuǎn)肝纖維化；方中多味藥及其不同化學(xué)成分在肝纖維化各個(gè)病理環(huán)節(jié)融對抗、保護(hù)、調(diào)節(jié)于一體，標(biāo)本兼治。已有臨床和基礎(chǔ)研究表明，F(xiàn)ZHY可以降低肝癌的惡性程度[6]，防治實(shí)驗(yàn)性肝癌的發(fā)生率[7-9]，然而其防治肝癌的活性成分以及潛在的作用機(jī)制尚不清楚。因此，基于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮藥理機(jī)制的作用特點(diǎn)，本研究以FZHY為載體，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子網(wǎng)絡(luò)水平系統(tǒng)探索該方多成分、多靶點(diǎn)與肝癌疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供線索。通過整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫信息收集整理FZHY的主要化學(xué)成分及其靶標(biāo)信息、肝癌相關(guān)基因信息，構(gòu)建FZHY治療肝癌的成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，旨在通過網(wǎng)絡(luò)分析解析FZHY治療肝癌的作用機(jī)制，為臨床和基礎(chǔ)科研提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 搜索FZHY主要活性成分的作用靶點(diǎn) FZHY中各味藥的成分信息從TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、Drugbank(https://go.drugbank.com/，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)等數(shù)據(jù)庫中檢索獲得；各成分的靶標(biāo)信息從TCMSP、Drugbank中獲取，構(gòu)建FZHY有效成分潛在的靶標(biāo)群。方中各味藥的歸經(jīng)信息從《中國藥典》(2015年版)中獲取。TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選過濾標(biāo)準(zhǔn)為：口服生物利用度(oral bioavailable,OB)≥30%且類藥性(drug likeness,DL)≥0.18，獲得FZHY多成分靶標(biāo)基因。

1.2 提取肝癌相關(guān)基因 通過檢索“Liver cancer”“Hepatic carcinoma”“Hepatoma”“Hepatocellular carcinoma”等關(guān)鍵詞，從GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)、OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM, https://omim.org，數(shù)據(jù)更新至2020-12-20)中搜索肝癌相關(guān)的基因，構(gòu)建肝癌致病基因的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，獲得肝癌疾病靶標(biāo)基因。

1.3 FZHY抗肝癌靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 對FZHY多成分靶標(biāo)基因和肝癌疾病靶標(biāo)基因進(jìn)行基因去重，繪制韋恩圖，獲得FZHY靶標(biāo)群與肝癌的共有基因，并在STRING數(shù)據(jù)庫(http://sring-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白互作關(guān)系(protein-protein interaction，PPI)分析。PPI分析模式限定為“Multiple proteins”，物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，設(shè)置可信度≥0.7，隱藏孤立的蛋白，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，再利用Cytoscape軟件建立多成分-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 利用R語言中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.EG.db”包對FZHY有效成分潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行功能注釋(gene ontology,GO)，即主要進(jìn)行分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)3個(gè)部分的富集分析，并對相關(guān)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定顯著性為P<0.05。

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 結(jié)合FZHY抗肝癌的主要成分、核心靶點(diǎn)與KEGG分析所得通路，運(yùn)用Cytoscape軟件繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，分析其整體關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 FZHY包含的成分及對應(yīng)靶標(biāo) FZHY由6味中藥組成，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選出中藥包含的主要成分共142個(gè)。合并各成分的靶標(biāo)基因，除去被多個(gè)成分共同調(diào)控的重復(fù)基因，獲得197個(gè)藥物靶標(biāo)基因(表1)。

2.2 FZHY的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析 分別以檢索詞“Liver cancer”“Hepatic carcinoma”“Hepatoma”“Hepatocellular carcinoma”在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索肝癌靶標(biāo)基因，分別獲得相應(yīng)疾病相關(guān)基因數(shù)(表2)。合并去除重復(fù)基因，共獲得疾病相關(guān)基因17 869個(gè)。

表2 在線數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞及疾病相關(guān)基因數(shù)

2.3 FZHY成分-基因-肝癌疾病靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)分析 對FZHY多成分靶標(biāo)基因和肝癌疾病靶標(biāo)基因進(jìn)行基因去重，繪制韋恩圖，獲得FZHY靶標(biāo)群與肝癌靶標(biāo)群的共有基因192個(gè)(藥物-疾病靶標(biāo)基因)(圖1)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建FZHY有效成分-肝癌靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)圖(附錄1)，得到FZHY治療肝癌的潛在化合物有95種，其中與肝癌靶標(biāo)基因連線最多為槲皮素和木犀草素(Mol ID: MOL000098、MOL000006)，提示槲皮素和木犀草素是FZHY調(diào)控肝癌的重要活性成分。PPI網(wǎng)絡(luò)分析藥物-疾病靶標(biāo)基因間的關(guān)系(附錄2)，根據(jù)基因-基因連線數(shù)分析PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因，顯示主要為INS、IL-6、EGFR等基因(圖2)，提示這些靶標(biāo)能被FZHY多味中藥和多個(gè)成分共同調(diào)控，因此在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中可能具有更重要的影響。

表1 FZHY包含化學(xué)成分的對應(yīng)靶標(biāo)數(shù)

圖1 基于GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫預(yù)測的肝癌與FZHY的靶點(diǎn)基因交集

圖2 FZHY治療肝癌的關(guān)鍵靶標(biāo)基因

2.4 網(wǎng)絡(luò)模型中重要靶標(biāo)生物功能分析 針對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO-BP分析，確定靶蛋白具有顯著性意義(P<0.05)的生物學(xué)過程主要涉及：對藥物的反應(yīng)、對氧水平的反應(yīng)、對類固醇激素的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對氧水平降低的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對酮的反應(yīng)、對營養(yǎng)物質(zhì)的反應(yīng)。GO-CC分析結(jié)果提示涉及的細(xì)胞組分主要有：突觸后膜、膜筏、膜微域、膜區(qū)、突觸膜、囊腔、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊腔、突觸膜整體成分、突觸后膜整體成分等。GO-MF分析結(jié)果提示涉及的分子功能主要有：DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、羧酸結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、類固醇結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體-激活轉(zhuǎn)錄因子活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、半胱氨酸-類型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、半胱氨酸-類型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路等(附錄3)。

對FZHY靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)前50位信號通路有22條與肝癌密切相關(guān)，具體見表3和附錄4。

用Cytoscape軟件構(gòu)建FZHY治療肝癌關(guān)鍵靶標(biāo)與關(guān)鍵信號通路的網(wǎng)絡(luò)圖(附錄5)，發(fā)現(xiàn)肝癌22條關(guān)鍵信號通路與FZHY治療肝癌的80個(gè)潛在靶點(diǎn)關(guān)系密切。

表3 FZHY治療肝癌關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG富集通路

3 討論

在我國，肝癌是肝炎后肝硬化最常見的并發(fā)癥[10]，給患者和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。盡管外科手術(shù)切除及肝移植、射頻消融、介入治療以及個(gè)性化化療方案和靶向藥物的應(yīng)用使得肝癌患者獲益良多，但復(fù)發(fā)仍是臨床所面臨的重大難題。對于難以手術(shù)切除肝癌的綜合治療方案，中西結(jié)合治療是提高肝癌療效的一個(gè)重要途徑[11-12]。FZHY(制劑為膠囊或片劑)由丹參、桃仁、蟲草菌絲、松花粉、五味子、絞股藍(lán)組成，對肝炎后肝硬化具有良好的治療效果[13]，已有國內(nèi)同行發(fā)表FZHY抗肝癌的相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究，但對于其抗肝癌的活性成分、作用靶點(diǎn)以及分子機(jī)制尚不完全明確。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子網(wǎng)絡(luò)角度系統(tǒng)分析了FZHY對肝癌的潛在治療機(jī)制，通過TCMSP平臺，篩選得到FZHY活性成分142種，藥物靶點(diǎn)基因197個(gè)；將FZHY對應(yīng)的靶點(diǎn)與肝癌的疾病靶點(diǎn)基因取交集，獲得交集基因192個(gè)，篩選得到潛在化合物95種，其中部分化合物抗肝癌的有效性及其藥理機(jī)制已被證實(shí)，起到重要調(diào)控作用的活性成分有：槲皮素、木犀草素等。據(jù)報(bào)道，槲皮素抗肝癌的作用可能與其滅活caspase/Cyto-c通路、抑制AP-2β/hTERT、NF-κB/COX-2、阻斷Akt/ERK1/2信號通路及競爭性抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT-1)密切相關(guān)[14-15];木犀草素可通過TGFβ1、p53和Fas/FasL三條信號通路抑制肝癌細(xì)胞生長[16]。上述化合物位于FZHY治療肝癌疾病-活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)的核心，可能在FZHY抗肝癌過程中起到重要作用。

進(jìn)一步對活性成分靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到80個(gè)抗肝癌靶點(diǎn)，涉及22條信號通路。FZHY潛在作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)有INS、IL-6、EGFR等；主要通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、TNF等信號通路而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡等多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用。研究顯示，胰島素可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞的凋亡，其功能與 Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)及 PI3K/AKT 信號通路密切相關(guān)[17]；IL-6在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，與肝癌惡性進(jìn)展呈正相關(guān)[18]，其對肝癌的正向調(diào)節(jié)作用可能與其抑制miRNA-197的表達(dá)來調(diào)節(jié)STAT3總蛋白質(zhì)的表達(dá)，繼而促進(jìn)p-STAT3的表達(dá)關(guān)系密切[19]；文獻(xiàn)報(bào)道，在29%～85%的肝癌組織中有EGFR過表達(dá)的現(xiàn)象[20]，甚至有專家建議將EGFR作為肝癌治療的靶點(diǎn)[21]，其機(jī)制可能為EGF/EGFR通過PI3K/AKT信號通路磷酸化p300 Ser1834位點(diǎn)，促進(jìn)組蛋白H3K9位點(diǎn)乙酰化，使DKK1的轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]。

通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY對于肝癌的調(diào)控主要集中在DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體結(jié)合等過程，提示FZHY可能通過抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。通過KEGG通路富集分析追蹤FZHY治療肝癌的代謝通路，并作FZHY治療肝癌關(guān)鍵靶標(biāo)的關(guān)鍵信號通路-基因網(wǎng)絡(luò)圖分析整體聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY主要作用于細(xì)胞凋亡、TNF等信號通路。其中凋亡信號通路可以影響胰島素的產(chǎn)生和釋放[23-24]，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)其凋亡。由此可知，F(xiàn)ZHY可能可以通過上述途徑發(fā)揮對肝癌的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)手段探討了FZHY活性成分與肝癌疾病及其相關(guān)基因的網(wǎng)狀關(guān)聯(lián)，通過研究該方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入開展的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考和線索。本課題組研究將圍繞其抗肝癌藥效物質(zhì)及作用機(jī)制開展進(jìn)一步基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究，以期開發(fā)出更適用于臨床治療肝癌的中藥制劑。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：齊婧姝負(fù)責(zé)撰寫修改論文；平大冰、孫鑫、薛靜波參與文獻(xiàn)的收集整理；彭淵、陶艷艷負(fù)責(zé)擬定寫作思路及制作網(wǎng)絡(luò)圖；劉成海負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

附錄1～5見二維碼