HBV相關肝細胞癌患者經長期核苷(酸)類藥物抗病毒治療后HBV RNA的表達水平及臨床意義

李 靜， 曹 宇， 馮永美， 郭遠強， 蔣 貝， 王春妍

1 天津醫科大學 研究生院， 天津 300192； 2 天津市第二人民醫院 a.科研室， b.肝病科， 天津 300192；3 南開大學 藥學院， 天津 300192

HBV感染仍然是一個嚴峻的全球性的健康問題，是導致肝衰竭、肝硬化、肝細胞癌(HCC)的重要危險因素。乙型肝炎病情的慢性化以及進展主要與HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)有關[1]。血清中的HBV RNA主要是3.5 kb的HBV RNA preC mRNA和pgRNA，其本質是前基因組RNA，只能轉錄自cccDNA[2-3]。Giersch等[4]研究證明pgRNA與cccDNA存在強相關性。HBV pgRNA可以反映肝細胞內cccDNA 的真實存在水平和轉錄活性[4-5]。HBV pgRNA的水平受核苷(酸)類似物(NAs)的影響較小，在長期接受抗病毒藥物治療患者的臨床檢測中更具有指導意義。Halgand等[6]研究提示pgRNA是病毒復制和預后的敏感標志物。故此，本研究擬針對HBV相關HCC患者長期應用NAs治療后，高敏HBV DNA低于檢測下限，進行HBV RNA檢測水平及意義分析，以期尋找長期NAs抗病毒治療，HBV DNA低于檢測下限，疾病進展可能原因。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019年6月—2020年8月天津市第二人民醫院收治的HBV相關HCC患者。所有病例診斷均符合《原發性肝癌診療規范(2019年版)》[7]，至少2年NAs抗病毒治療，至少2次間隔3個月經羅氏試劑檢測高敏HBV DNA檢測小于20 IU/mL，排除其他肝炎病毒、酒精性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病所致肝癌患者。所有HCC患者均經過手術切除、消融、介入或分子靶向藥物治療，再次或反復出現腫瘤復發或新發。

1.2 檢測方法 HBV DNA定量檢測試劑購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，檢測采用熒光定量PCR法，檢測下限為20 IU/mL。HBV RNA定量檢測試劑購自中國湖南圣湘生物科技有限公司，檢測下限為100 IU/mL。HBV血清標志物采用化學發光法檢測，試劑購自雅培醫療(上海)有限公司。肝功能檢測使用日本日立7180自動生化儀。

1.3 倫理學審查 本研究經天津市第二人民醫院醫學倫理委員會批準，批號：津二人民倫審字[2018]15號。

2 結果

2.1 一般情況 共納入患者60例，其中男47例，女13例，年齡32～79歲(表1)。

表1 入組患者一般資料

2.2 AFP不同水平HBV RNA定量比較 根據AFP水平不同，分為AFP陽性組及AFP陰性組，兩組HBV RNA水平分別為0(0～3.57)、0(0～2.00)，差異無統計學意義(Z=-1.474，P=0.141)。

2.3 BCLC不同分期HBV RNA定量比較 根據BCLC分期不同，分為BCLC A期、B+C+D期，兩組HBV RNA水平分別為0(0～2.0)、0(0～2.0)，差異無統計學意義(Z=-0.607，P=0.544)。

2.4 HBeAg不同水平HBV RNA定量比較 根據HBeAg水平不同，分為HBeAg陽性組和HBeAg陰性組，兩組HBV RNA水平分別為2.99(0～4.80)、0(0～0.50)，差異有統計學意義(Z=-3.400，P=0.001)。

2.5 HBsAg不同水平HBV RNA定量比較 根據HBsAg水平不同，分為A、B、C 3組，分別為HBsAg≤100 IU/mL、100 IU/mL

2.6 相關分析 分別以年齡、ALT、AST、GGT、ALP、HBsAg、HBeAg、AFP值作為自變量，血清中HBV RNA水平作為因變量，進行相關分析， HBsAg滴度與HBV RNA水平相關(r=0.292，P<0.05),其余無相關性(P值均>0.05)。

3 討論

NAs對cccDNA無直接抑制和清除作用[8]，即使能快速有效抑制HBV DNA低至檢測下限，肝臟中存在的cccDNA仍在影響病毒的復制[9]，使得NAs長期治療的患者仍有一部分會發展至終末期肝病，甚至肝癌[10]。

本研究發現，在60例HBV相關HCC經長期抗病毒治療患者中，HBV RNA檢測陽性者9例，占比15%。提示在HBV DNA低于檢測下限后，仍存在部分患者HBV RNA陽性，應進一步追求血清中HBV RNA低于檢測下限作為病毒學應答指標。

HBeAg是由C區的前C基因編碼而來，HBeAg陽性通常被認為具有高感染性。本研究入組HBeAg陰性患者46例，HBV RNA陽性2例(4.3%)；HBeAg陽性患者14例，HBV RNA陽性7例(50.0%)，且HBV RNA水平更高(Z=-3.400，P=0.001),差異有統計學意義。但Pearson相關分析提示，HBV RNA水平與HBeAg水平沒有相關性。分析HCC患者已處于肝病終末期，經長期抗病毒治療后，HBV DNA定量低于檢測下限，大多數患者已出現HBeAg血清學轉換；或者可能出現PreC區和基本核心啟動子區頻繁突變，HBeAg減少或完全喪失，故此HBeAg滴度高低可能與HBV RNA水平無明顯相關性。

HBsAg是HBV感染的傳統血清學標志物，HBsAg陰轉被認為臨床治愈[8]。HBsAg的持續存在是慢性乙型肝炎患者發展為肝硬化和HCC的危險因素。當血清中HBV DNA低于檢測下限時，HBsAg完全由cccDNA編碼而來，而HBV RNA為cccDNA的轉錄產物。故此，本研究深入分析HBV RNA水平與HBsAg之間的關系，發現不同HBsAg組間HBV RNA定量差異有統計學意義。Pearson相關分析提示，HBV RNA滴度與HBsAg水平具有相關性(r=0.292，P<0.05)。血清HBsAg滴度越高，HBV RNA水平越高，肝內cccDNA水平高，預示病毒轉錄狀態活躍，可能更易出現腫瘤，病情進展。

本研究也發現，AFP水平與HBV RNA水平無關。HCC早期患者與其他各期相比，HBV RNA水平沒有差異，提示HBV RNA水平對于HCC的診斷及疾病所處狀態沒有預測價值。

由于HBV RNA檢測在臨床中尚未廣泛應用，檢測試劑尚未標準化，本研究尚存在一定的局限性。后續研究擬入組初次發現肝臟腫瘤患者，經過根治治療，隨訪2～3年，以觀察HCC患者生存期、腫瘤復發/新發與HBV RNA之間的關系。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：李靜負責收集整理資料，撰寫論文；曹宇負責實驗操作；馮永美負責統計分析；蔣貝負責患者入組及篩選；郭遠強負責分析、解釋數據；王春妍負責指導撰寫文章，修改論文。