調節性T細胞在熱射病大鼠發病機制中的作用探討

趙佳佳，張科學，周京江，胡 婕，宋 青北京順義區醫院 麻醉科，北京 10100； 解放軍總醫院第七醫學中心 小兒外科，北京 10085； 解放軍總醫院第一醫學中心 重癥醫學科，北京 10085

熱射病(heat stroke，HS)是以中樞神經系統功能障礙、持續高熱并迅速發展為多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)為特征的一種疾病。熱應激引起的急性炎性反應是驅動HS最終發展為MOF的根本原因[1-3]，導致其相關炎性反應的細胞學機制尚未探明。調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是一類控制自身免疫反應的T細胞亞群，其在維持免疫耐受和免疫平衡方面發揮著重要作用[4]。研究發現Tregs參與多種與炎性反應相關的疾病，如膿毒癥、克羅恩病等[5-6]。我們前期研究發現，HS大鼠發病前期Tregs比例升高，提示Tregs可能在熱射病發病機制中扮演著重要角色[7-10]。Tregs調控HS發病后炎性反應及免疫功能的相關機制亟待探明。本研究通過分析大鼠發生HS后血清炎性因子、外周血及脾中Tregs占比和脾組織中Tregs細胞凋亡率變化情況，探討Tregs與HS免疫功能紊亂之間的關系，旨在為T regs參與HS免疫紊亂相關機制的研究提供線索。

材料和方法

1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠SPF級，8周齡，體質量240～280 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)2012-0004。隨機分為Control組(n=10)和HS組(n=50)，HS組按發病后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h取樣時 間點分為5個亞組(n=10)。

2 主 要 試 劑 檢 測 白 細 胞 介 素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10的ELISA試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司。PBS緩沖液、紅細胞裂解液、Annexin V-Alexa Fluor488/PI購自北京四正柏生物技術有限公司。Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD25 APC、Mouse Regulatory T Cell Staining Kit #1 Kit、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、P E/Cy7 anti-rat CD4購自美國BioLegend公司。

3 HS動物模型建立 仿真模擬熱氣候環境建立高溫高濕[溫度(38 ± 0.5)℃，濕度80% ± 10%]實驗艙。腹腔注射10%水合氯醛將HS組大鼠麻醉(4 mL/kg)并置于實驗艙中，每隔10 min檢測大鼠肛溫，達40℃以上時改為每隔5 min檢測1次。高溫應激大鼠肛溫 ≥ 42℃為造模成功標志。對照組大鼠置于溫度(25 ± 1)℃、相對濕度60% ± 5%的 環境中正常飼養，不做任何處理。

4 標本采集 在相應時間點(HS發病后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)將實驗大鼠麻醉后經右側頸動脈置管取血收集于肝素抗凝管中，用于外周血Tregs檢測；余血液置于生化管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液置于2.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，備檢細胞因子。取血后，剖腹留取脾組織置于盛有PBS溶液的EP管后放入冰盒中，用 于檢測脾Tregs。

5 血 清 細 胞 因 子 檢 測 采 用 酶 聯 免 疫 吸 附法(ELISA)檢測IL-2、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10濃 度，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

6 外周血調節性T細胞檢測 新鮮抗凝動脈血，1 500 r/min離心10 min，移去上清液；每l mL細胞沉淀體積加入10 mL 10倍稀釋后的紅細胞裂解液，吹打混勻(注意要輕柔)，常溫避光裂解15 min；1 500 r/min離心15 min，棄去上清液；加入5 mL PBS緩沖液，吹打混勻，1 500 r/min離心5 min，移去上清液。加入5 mL PBS緩沖液，細胞計數板進行細胞計數，調整細胞濃度至106/mL。取100 μL細胞懸液置于流式細胞檢測管中，按細胞表面抗原染色方法標記表面抗原CD4-FITC (0.25 μg/Test)、CD25-APC(0.125 μg/Test)，避光4℃孵育40 min。5 mL PBS緩沖液洗滌細胞。漩渦震蕩重懸細胞后加入1 mL的固定/破膜液(Fixation/Permeabilization)，并再次混勻，4℃避光孵育40 min；加入2 mL破膜液離心洗滌細胞并棄去上清液。細胞染色緩沖液洗細胞，離心，棄去上清液；加入用破膜液稀釋的1 μg anti-mouse CD 16/32，避光4℃孵育15 min；加入稀釋的熒光標記Foxp3抗 體0.5μg/20μL/Test，避 光4℃孵 育40 min；加入2 mL破膜液液離心洗滌細胞2次；用0.5 mL流式細胞緩沖液進行細胞重懸，上機檢測 并分析。

7 脾調節性T細胞檢測 將離心管中的脾取出，放入200目細胞篩中，加PBS緩沖液研磨(每次加1 mL)，收集濾出液。將收集的濾出液置于離心管中，2 000 r/min離心10 min，移去上清液；加入5 mL PBS緩沖液，吹打混勻，重新用200目細胞篩過濾，收集濾出液，重復該步驟1次；之后步 驟同外周血調節性T細胞檢測。

8 脾組織調節性T細胞凋亡檢測 脾組織染色前處理步驟與脾調節性T細胞檢測部分相同。處置后加入PE/Cy7 anti-rat CD4和PE-anti-rat CD25抗體，4℃下避光孵育30 min，進行表面染色。加入100 μL Binding Buffer和10 μL Annexin V-Alexa Fluor488/PI，室溫避光孵育30 min后加入200 μL流式細胞緩沖液重懸，重懸后立即上機進行流式細胞學技術定量檢測。先選出CD4+CD25+雙陽T細胞后再對其中Anexin V染色陽性T細胞進行定 量分析。

9 統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行統計分析。計量資料以 x± s表示，兩組均數間比較采用t檢驗，Pearson相關檢驗分析脾組織中調節性T細胞表達與血清中細胞因子表達的相關性。P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組血清細胞因子表達比較 與對照組比較，HS組大鼠血中TNF-α、IL-2、IL-6在各時間點均升高(P＜0.05)，整體變化呈先升高后降低趨勢，峰值時間在12 h(TNF-α、IL-2)和24 h(IL-6)。血清中TGF-β、IL-10水平呈現逐漸上升趨勢，且在各時 間點均較對照組高(P＜0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠血清細胞因子表達比較 (aP＜0.05，vs control group)F ig.1 Comparison of serum cytokine expression between the two groups (aP＜0.05, vs control group)

2 兩 組 血 中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比 例 比 較 HS組血中Tregs比例在6 h時低于對照組(P＜0.05)，之后呈升高趨勢，在48 h、72 h時高于 對照組(P＜0.05)。見圖2。

3 兩 組 脾 中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比 例 比較 HS組脾中Tregs比例在6 h及12 h時低于對照組(P＜0.05)，之后呈升高趨勢，在24 h、48 h及 72 h時高于對照組(P＜0.05)。見圖3。

圖3 脾中CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs表達水平 (aP＜0.05，vs control group)F ig.3 Expression of CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs in spleen (aP＜0.05, vs control group)

4 兩 組 脾 組 織CD4+CD25+Foxp3+Tregs凋 亡 率比較 HS組在6 h時脾中Tregs凋亡率較對照組高，之后呈逐漸降低趨勢，于24 h開始低于對照組 (P＜0.05)。見圖4。

圖4 脾中CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs凋亡率比較(aP＜0.05，vs control group)F ig.4 Apoptosis rates of CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs in spleen (aP＜0.05, vs control group)

5 血清細胞因子中IL-10、TGF-β表達與血中調節性T細胞表達的相關性 血清細胞因子中IL-10、TGF-β表達與血中調節性T細胞表達呈正相關，與脾組織中調節性T細胞表達呈正相關，與脾組織中調節性T細胞凋亡率呈負相關(P＜0.05，見表 1)。

表 1 血、脾組織中調節性T細胞表達與血清中細胞因子表達的相關性Tab. 1 Correlation between cytokines expressions in serum and Tregs expressions in blood and spleen

討 論

全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是HS發生、發展及惡化的關鍵環節，炎性介質是促發、增強和放大炎性反應的中心環節[1]。有文獻報道HS的病理生理過程類似于膿毒癥，在整個疾病發病過程中促炎因子與抗炎因子始終存在，兩者在疾病發病前期即升高[5]。在促炎因子方面，有研究認為IL-6、IL-2受體等可作為評價HS病情嚴重程度的預測指標[11-13]。本研究結果顯示HS大鼠外周血、脾組織Tregs比例較對照組先降低后升高，且隨病情進展呈進行性升高；脾組織Tregs凋亡率先增加，于24 h后顯著減少，且隨時間推移逐漸減少。血清中IL-10、TGF-β變化與血及脾中Tregs變化呈正相關，與脾組織中Tregs凋亡率呈負相關。HS炎性反應狀態與Tregs數量的變化具有很好的一致性，提示HS大鼠可能通過調節Tregs數量來調控機體炎性因子IL-10、TGF-β的變化，參與HS的炎性反應發病機制。

Tregs作為T淋巴細胞的一類亞群，占正常機體外周血及脾T淋巴細胞的5%～10%，對調控炎性反應和維持機體免疫穩態具有重要作用[4]。有研究表明在HS患者SIRS的發病過程中，血中白細胞和淋巴細胞數量顯著增加[14]。本研究發現在HS前期(6 h)脾組織中Tregs凋亡率顯著升高，外周血和脾組織中Tregs比例顯著降低，前期Tregs降低不利于機體對抗過度的炎性反應[15-16]。HS大鼠在發病后24 h Tregs數量明顯增加，且隨時間進行性升高，在發病72 h時其比例較正常組升高2～3倍。有研究發現膿毒癥小鼠脾組織中Tregs比例顯著升高，在膿毒癥死亡患者血清中也同樣發現Tregs比例均較存活患者明顯升高[5]，提示機體Tregs持續升高可能是導致不良預后的原因。有研究推測隨著Tregs的持續增加，免疫抑制狀態加劇，HS病情進一步惡化，最終導致機體發生免疫麻痹甚至死亡[6]。

免疫抑制因子TGF-β、IL-10是Tregs分泌的主要細胞因子，可通過與局部相關生長因子競爭，延長細胞增殖周期，抑制免疫效應。已有文獻報道Tregs可調節TGF-β的表達[17]。我們對HS大鼠外周血及脾組織中Tregs變化進行了長達72 h的觀察。在發病24 h后，HS大鼠外周血及脾組織中Tregs比例均較對照組升高，脾組織Tregs凋亡率則顯著降低，結合細胞因子的變化，于24 h后促炎因子IL-2、TNF-α開始下降，而抗炎因子IL-10、TGF-β持續升高，考慮機體可能通過上調Tregs數量抑制炎性反應，使抗炎反應逐漸增強，導致代償性抗炎反應綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)[18]。該時期SIRS與CARS相互制衡，最終抗炎反應占優勢，機體出現免疫抑制或免疫麻痹，導致多臟器功能衰竭甚至死亡[19-20]。

本研究通過探索熱射病大鼠發病時Tregs及相關炎性因子的變化研究Tregs在熱射病發病中的作用及可能的炎性因子調節機制，展示了Tregs和相關促炎因子、抗炎因子的變化規律及兩者間的相關性分析，基于研究結果及相關文獻，認為Tregs可能參與了HS的炎性反應發病機制。不足在于本項研究屬于觀察性探索，未來應采用體、動態研究技術方法，結合特異性敲除Tregs的實驗動物模型，對Tregs進行干預后探索其對HS發病的影響。