21-三體綜合征孕婦的羊水和血漿氨基酸靶向定量分析

劉曉婷，付玉榮，馬 瑩，張文玲，王曉菲，汪偉偉，張晨晰，張立文，王成彬 解放軍總醫院第一醫學中心 檢驗科，北京 0085； 解放軍總醫院第一醫學中心 婦產科實驗室，北京 0085； 解放軍總醫院 轉化醫學實驗室，北京 0085

21-三體綜合征，又稱唐氏綜合征，既是目前最常見的一種染色體數目異常疾病，又是最常見的導致輕度至中度智力障礙的遺傳性疾病[1]。其發生率較高，活產新生兒中占1/(600～800)[2]。研究表明，21號染色體在減數分裂中不分離引起基因表達的異常，進而造成人體內許多代謝物質的含量發生變化是其主要發生機制，其中21q22是關鍵區域，CAF1P60[3]、SOD-1[4]、CBS[5]等基因參與調控21-三體綜合征的發生發展。此外，21-三體綜合征的發生與孕婦的羊水或血液中的氨基酸水平也有著密切關系[6-8]。靶向代謝組學可以檢測特定群組的代謝物在樣品中的絕對含量，是代謝組學研究中的重要組成部分，更是非靶向代謝組研究的延伸與拓展[9-10]。通過靶向代謝組學研究，可以驗證非靶向代謝組學研究提出的假設，并分析可能的疾病機制。本研究組前期通過非靶向代謝組學對21-三體綜合征進行相關研究，結果顯示，在21-三體綜合征孕婦羊水中有151種代謝物發生顯著變化。其中較低表達水平的有糖皮質激素代謝物、谷胱甘肽代謝物及多種γ-谷氨酰氨基酸代謝物；較高表達水平的有磷脂代謝物、碳水化合物代謝物及二羧酸鹽類代謝物[11]。其中，氨基酸變化趨勢較為明顯。為了驗證以上結果并進行進一步的相關研究，本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)對21-三體綜合征孕婦的羊水和血漿進行氨基酸靶向定量分析，對前期非靶代謝組學的部分研究結果進行進一步驗證，并探討氨基酸含量變化與21-三體綜合征的相關性。

材料與方法

1 樣本來源 選取2018年3月- 2019年3月于解放軍總醫院第一醫學中心行羊膜腔穿刺羊水染色體核型檢測診斷為胎兒21-三體綜合征的10例孕婦為實驗組，同期羊穿診斷為胎兒核型正常的10例孕婦為對照組，分別留取兩組孕婦的羊水和血漿樣本。兩組孕婦的年齡、孕周(18～20周)、所懷胎兒性別等臨床資料差異無統計學意義。本研究的所有參加者均已簽訂科研知情同意書，并經 醫院倫理委員會批準同意(S2018-282-02)。

2 儀器與試劑 UPLC H-class(Waters)、多管渦旋混合儀(IKA)、移液器(10～100 μL，100～10 000 μL，Eppendorf)、Milli-Q超純水儀(18.2 MΩ?cm)、電熱恒溫干燥箱(上海賀德實驗設備有限公司)、醫用高速冷凍離心機(eppendorf)。乙腈(色譜級)、超純水(millipore超純水機自制)、磷酸(85%，天津大荗化學制劑廠)、AccQTag Ultra Eluent A Concentrate(Waters)、AccQTag Ultra Eluent B(Waters)、AQC衍 生試劑(Waters)等。

3 標準品 20種氨基酸標準品：L-精氨酸(Arg)、L-組 氨 酸(His)、L-異 亮 氨 酸(Ile)、L-亮 氨酸(Leu)、L-賴氨酸(Lys)、L-甲硫氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-蘇氨酸(Thr)、L-纈氨酸(Val)、L-丙氨酸(Ala)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酸(Glu)、L-甘氨酸(Gly)、L-脯氨酸(Pro)、L-絲氨酸(Ser)、L-酪氨酸(Tyr)、L-色氨酸(Trp)、L-牛磺酸(Tau)、L-鳥氨酸(Orn)均購自W aters公司。

4 實驗方法 應用超高效液相色譜-串聯質譜，檢測羊水和血漿中20種氨基酸含量。取一定體積待測樣品(血漿與羊水)或質控品，加入等比例乙腈，混勻30 s，在高速離心機上以13 000 r/min離心20 min。在進樣小瓶中分別加入樣本上清液和50 μmol/L的20種氨基酸混標，分別快速加入20 μL AQC衍生試劑，立即渦旋混合數秒鐘，在室溫下放置1 min。將樣品瓶置于恒溫加熱儀內，衍生化10 min。打開儀器，并進入操作系統，待儀器自檢完成后，打開Empower軟件，進入工作站主界面。樣品分析采集完畢后通過瀏覽項目選擇進入氨基酸小組處理數據，采用外標法和多點校 正曲線定量氨基酸含量。

5 統計學方法 采用SPSS20.0軟件成組t檢驗分析兩組的氨基酸含量，P＜0.05為差異有統計學意義。利用多元變量SIMCA分析軟件(version 13.0，Umetrics，Sweden)的正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminate analysis，O PLS-DA)進行兩組間的判別分析。

結 果

1 羊水中氨基酸定量分析 質譜檢測結果顯示，除脯氨酸(Pro)和牛磺酸(Tau)外，其他18種氨基酸含量實驗組均較對照組低，其中10種氨基酸(Arg、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Val)含量組間差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 1。

圖1 20種氨基酸在羊水樣本中定量分析箱式圖(aP＜0.05, vs control)F ig.1 Quantitative analysis diagram of 20 kinds of amino acids in amniotic fluid sample (aP＜0.05, vs control)

2 血漿中氨基酸定量分析 20種氨基酸中有16種氨基酸含量實驗組較對照組低，分別為Ala、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；4種氨基酸含量實驗組較對照組高，分別為Arg、Orn、Pro、Tau。其中Gly兩組間差異有統計學意義 (P=0.019)。見圖2。

3 兩組氨基酸多元變量分析 羊水氨基酸OPLSDA結果顯示，實驗組和對照組羊水氨基酸檢測結果分別分布于左右兩個象限，說明二者在OPLSDA分析中可以得到較好的分離(圖3)。血漿氨基酸OPLS-DA結果顯示，實驗組和對照組血漿氨基酸檢測結果在圖中分布有交叉，說明二者在O PLS-DA分析中不能得到很好的分離，見圖4。

圖3 羊水樣本實驗組和對照組的OPLS-DA圖(綠點：對照組；藍點：實驗組)Fig.3 OPLS-DA diagram of amniotic fluid sample in experimental group and control group (green dots: control group; blue dots: experimental group)

圖4 血漿樣本實驗組和對照組的OPLS-DA圖(綠點：對照組；紅點：實驗組)Fig.4 OPLS-DA diagram of plasma sample in experimental group and control group (green dots: control group; red dots:experimental group)

討 論

本研究通過超高效液相色譜-串聯質譜(UPLCMS/MS)對21-三體綜合征孕婦的羊水和血漿進行氨基酸靶向定量分析，結果顯示氨基酸靶向定量分析結果與前期非靶代謝研究結果基本吻合[8]，羊水中變化趨勢相同的代謝物有18種，16種降低(其中10種有統計學差異)，2種增高。血漿中變化趨勢相同的代謝物有9種，6種降低，3種增高。非靶代謝組學通過隨機森林分析篩選出來的羊水中的6種重要氨基酸(His、Ser、Gly、Glu、Leu和Phe)和血漿中的半胱氨酸(Cys)在靶向定量分析中也得到了驗證。以上結果表明，前期非靶代謝組學研究結果是真實可信的，其初步篩選得到的兩組中顯著變化的代謝物可能與21-三體綜合征的發生發展有一定的相關性。

已有研究表明，與對照組相比，21-三體綜合征孕婦羊水中部分氨基酸表達水平下降。如Huang等[6]研究中的精氨酸、組氨酸和谷氨酸，Amorini等[11]研究中的谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸、纈氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、酪氨酸和亮氨酸。本研究團隊前期研究證實了上述文獻報道的部分氨基酸代謝物的變化，同時發現了更多的21-三體綜合征組中低表達的游離氨基酸，而且同時在非靶和靶向代謝物研究中得到了驗證[8]。

21-三體綜合征孕婦異常表達的上述氨基酸與21-三體綜合征的發生發展有一定的相關性。在胎兒發育過程中，谷氨酰胺-谷氨酸代謝通路信號相關的關鍵成分發生了變化[12-14]。由于谷氨酸是海馬神經元存活與否的重要因素，谷氨酸代謝水平差異是導致21-三體綜合征患者行為缺陷的常見原因[15]。21-三體綜合征患者的血小板和成纖維細胞對谷氨酸的攝取明顯減少，在海馬區對谷氨酸的攝取也明顯減少[16-17]。由于谷氨酰胺是由谷氨酸合成的，谷氨酸-谷氨酰胺循環在神經元激活中起著關鍵作用，谷氨酰胺的增加和谷氨酸的減少可能反映了這一循環的失衡。21號染色體上的一些基因與谷氨酸的遺傳傳遞有關，如小鼠Glur-5基因映射到16號染色體，同源人類GLUR5基因映射到人類21號染色體的相應區域；因此，GLUR5的劑量不平衡可能在小鼠和人類的21-三體綜合征表型中都有作用[18]。雙底物特異性酪氨酸磷酸化調節激酶1A(DYRK1A)是一種保守性的蛋白激酶[19]。阿爾茨海默病與21-三體綜合征患者在學習記憶方面的損傷與DYRK1A有關，DYRK1A位于21號染色體的關鍵區域，其可在酪氨酸上自身磷酸化，但磷酸化的底物是絲氨酸和蘇氨酸[20-22]。研究還發現，在10~25歲的青少年中，21-三體綜合征患者血漿中絲氨酸的代謝水平與對照組相比明顯降低[23]。

通過有監督的OPLS-DA統計分析，我們發現實驗組與對照組的羊水中氨基酸有明顯的分離，證實了氨基酸類代謝物在兩組的羊水中有顯著性差異。查閱文獻發現，某些代謝物表達水平在血漿與羊水中保持著很強的相關性或相似性，因此通過檢測母體血漿中相關的代謝物來確定羊水中某些代謝物的變化是可行的[24-28]。本研究證實了21-三體綜合征孕婦血漿和羊水中常見氨基酸靶向與非靶代謝組學的結果基本一致。但是血漿是受機體調節而趨向穩態的樣品類型，因此血漿中的部分相關代謝物變化并沒有羊水中的變化明顯，甚至沒有太多差異。

綜上，本研究通過靶向定量測定21-三體綜合征孕婦羊水與血漿中20種氨基酸的含量，證實了羊水和血漿的氨基酸實際含量變化與非靶向檢測結果基本一致，21-三體綜合征孕婦的羊水和血漿中20種氨基酸的含量普遍下降，表明部分氨基酸與21-三體綜合征可能存在一定的相關性。