Smad2/3蛋白在乳腺病變中的表達(dá)與剪切波彈性特征的相關(guān)性

李詩雨，張夢珂，王知力

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 超聲診斷科，北京 100853

近些年，乳腺癌的發(fā)病率高居女性癌癥之首，據(jù)估計(jì)每8名女性中就有1名罹患乳腺癌[1]。剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)作為篩查乳腺癌的一種超聲診斷技術(shù)，通過對病變組織硬度進(jìn)行定量、定性評估，可以精確區(qū)分良惡性病變[2-3]。前期研究表明，與正常組織相比，腫瘤組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中常含有較多的膠原纖維和彈性纖維，是導(dǎo)致乳腺癌硬度增加的根本原因[4]。Smad2與Smad3高度相似，同屬Smad(Sma-Mad)族蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控許多細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)，包括膠原蛋白和纖維連接蛋白[5]。若Smad2/3異常表達(dá)，不僅促進(jìn)ECM中膠原蛋白和纖維蛋白的過度沉積，還會(huì)抑制ECM的降解[6]。然而，Smad2/3的表達(dá)水平與乳腺病變的彈性特征是否具有相關(guān)性未見報(bào)道。本研究擬探究Smad2/3的表達(dá)與乳腺病變彈性特征的相關(guān)性。

方 法

1 資料 選取2018年4 - 10月解放總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心130例女性乳腺病變患者(135個(gè)腫塊)。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)病理診斷結(jié)果明確；2)經(jīng)過常規(guī)超聲檢查及SWE檢查；3)接受超聲引導(dǎo)穿刺活檢、旋切活檢或手術(shù)切除；4)病理標(biāo)本經(jīng)過針對Smad2/3的免疫組化染色；5)已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)接受新輔助化療或放療；2)缺少臨床 、病理和預(yù)后隨訪信息。

2 SWE檢查 SWE檢查采用Aixplorer超聲系統(tǒng)(法國普羅旺斯艾克斯市超聲成儀)，探頭頻率4～12 MHz。所有病灶均行SWE檢查。在病灶處進(jìn)行常規(guī)超聲檢查后，切換到剪切波彈性成像模式，垂直于皮膚緩慢平穩(wěn)移動(dòng)4 s，待圖像穩(wěn)定后將其保存。選擇感興趣區(qū)域，使取樣框盡量覆蓋全部病灶，特別是在最硬部位。在病灶的3個(gè)不同切面定位測量，記錄3種不同切面病灶組織的最大彈性模量、平均彈性模量和最小彈性模量，并測量同一深度下正常乳腺組織與周圍乳腺組織的彈性模量比值。此外，還記錄有無“硬環(huán)征”存 在。

3 Smad2/3檢測 對經(jīng)過手術(shù)或活檢的女性乳腺病變組織先進(jìn)行甲醛固定、石蠟包埋，再將其切成4 μm厚的切片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，對石蠟切片先后進(jìn)行烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、抗原封閉、滴加一抗和二抗增強(qiáng)液、顯色、襯染、分化、脫水、封片等，觀察Smad2/3在人類乳腺標(biāo)本中的表達(dá)分布情況[7]。圖像分析使用Image-Pro Plus 6.0。400×下的每一片切片取5個(gè)感興趣區(qū)域，測量該區(qū)域的集成光密度和面積，計(jì)算平均光密度(集成光密度/面積)。以平均光密度評價(jià)Smad2/3的表達(dá)水平，至少由2名病理科醫(yī)生獨(dú)立觀 察切片。

4 觀察指標(biāo) 本研究的主要觀察指標(biāo)包括Smad2/3、最大彈性模量、平均彈性模量、最小彈性模量以 及“硬環(huán)征”。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以 x ˉ±s表示，不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)M（P25，P75）形式來表達(dá)。計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較乳腺良、惡性病變組Smad2/3表達(dá)水平。行秩檢驗(yàn)比較乳腺良、惡性病變組最大彈性模量、平均彈性模量、最小彈性模量、病變與周圍正常組織的比值。使用Pearson相關(guān)分析探究Smad2/3表達(dá)水平與乳腺病變彈性參數(shù)的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建立ROC診斷曲線，評價(jià)Smad2/3、最大彈性模量、平均彈性模量、最小彈性模量、“硬環(huán)征”及Smad2/3+“硬環(huán)征”對乳腺良惡性病變的鑒別診斷效能、截?cái)嘀?、敏感度、特異性、?zhǔn)確性。使用Z檢驗(yàn)比較各 ROC曲線下面積(AUC)。

結(jié) 果

1 納入患者一般情況及病理結(jié)果 患者年齡18～73(44±12)歲；病灶最大直徑0.4～5.5(1.6±0.8) cm。病理結(jié)果顯示，乳腺良性病變84例(62.2%)，其中腺病40例，纖維腺瘤32例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤3例，炎性病變8例，良性葉狀瘤1例。惡性病變51例(37.8%)，其中浸潤性癌46例，導(dǎo)管內(nèi)癌3 例及黏液癌2例(表1)。

2 乳腺良惡性病變Smad2/3表達(dá)水平比較 在所有乳腺病變中，Smad2/3的平均光密度為0.142±0.105。其中，Smad2/3在乳腺惡性病變中的表達(dá)水平明顯高于其在良性病變中的表達(dá)水平(0.299±0 .011 vs 0.104±0.009，P＜0.001；表2)。

表 1 130名患乳腺病變女性患者臨床特征Tab. 1 Clinical features of 130 female patients with breast lesions

表 2 良惡性乳腺病變的彈性參數(shù)和Smad2/3比較Tab. 2 Comparison in elasticity parameters and Smad2/3 between the benignity and the malignancy

3 Smad2/3表達(dá)水平與彈性特征的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示Smad2/3的表達(dá)水平與最大彈性(r=0.657，圖1A)、平均彈性(r=0.640，圖1B)及病灶與周圍組織彈性模量的比值(r=0.470，圖1C)呈正相關(guān)。Smad2/3在有“硬環(huán)征”的乳腺病灶中的表達(dá)水平明顯高于無“硬環(huán)征”的病灶( 0.251±0.076 vs 0.075±0.050，圖2，圖3)。

圖1 Smad2/3表達(dá)水平與病變彈性特征的相關(guān)性A：Smad2/3表達(dá)水平與最大彈性模量相關(guān)；B：Smad2/3表達(dá)水平與平均彈性模量相關(guān)；C：Smad2/3表達(dá)水平與病灶與周圍組織彈性比值相關(guān)Fig.1 Correlation between Smad2/3 expression level and elastic characteristics of lesions.A: Correlation between Smad2/3 expression level and maximum elasticity; B: Correlation between Smad2/3 expression level and mean elasticity; C: Correlation between Smad2/3 and the ratio of elasticity between lesions and peripheral tissues

圖2 乳腺惡性病變病例。29歲女性，浸潤性癌。SWE示最大彈性模量233.2 kPa，平均彈性模量137.4 kPa，病變與周圍組織彈性比值6.9，可見“硬環(huán)征”(A)；免疫組化染色示Smad2/3表達(dá)呈強(qiáng)陽性，平均光密度為0.339 7 (400×，B)Fig.2 A 29-year-old woman with invasive breast cancer. SWE showed that the maximum elastic modulus was 233.2 kPa, the average elastic modulus was 137.4 kPa, and the elastic ratio of lesions to peripheral parenchyma was 6.9, with“ stiff rim sign”(A); Immunohistochemical staining showed strong positive expression of Smad2/3, with an average optical density of 0.339 7 (400×, B)

圖3 乳腺良性病變病例。60歲女性，乳腺纖維腺瘤。SWE示最大彈性模量16.7 kPa，平均彈性模量8.5 kPa，病變與周圍組織彈性比值0.7，未見“硬環(huán)征(A)；免疫組化染色示Smad2/3表達(dá)水平為0.022 4 (400×，B)Fig.3 A case of benign breast lesions. The patient was a 60-year-old woman with breast fibroadenoma. Shear wave elastography showed that the maximum elastic modulus was 16.7 kPa, the average elastic modulus was 8.5 kPa, and the elastic ratio of lesions to peripheral parenchyma was 0.7, without “stiff rim sign” (A). Immunohistochemical staining showed that the expression level of Smad2/3 was 0.022 4 (400×, B)

4 Smad2/3、彈性特征、“硬環(huán)征”及Smad2/3+“硬環(huán)征”的診斷性能 病灶最大彈性模量、平均彈性模量、病灶與周圍組織的彈性比值、“硬環(huán)征”、Smad2/3、Smad2/3+“硬環(huán)征”的診斷效能見表3。Smad2/3+“硬環(huán)征”的特異性并不高于“硬環(huán)征”(P＜0.05)，但在所有指標(biāo)中，其診斷敏感度和準(zhǔn)確性均顯著高于“硬環(huán)征”(P＜0.05，表3)。Smad 2/3表達(dá)水平、病變彈性特征、“硬環(huán)征”、Smad 2/3+“硬環(huán)征”對乳腺良惡性病變鑒別診斷的R OC曲線見圖4。

圖4 Smad2/3表達(dá)水平、病變彈性特征、“硬環(huán)征”、Smad2/3+“硬環(huán)征”對乳腺良惡性病變鑒別診斷的ROC曲線Fig.4 ROC curves of the differential diagnosis of benignity and malignancy by Smad2/3 expression level, the elastic characteristics of lesions, “stiff rim sign” and Smad2/3 combined with “stiff rim sign”

討 論

剪切波彈性成像在乳腺癌的鑒別診斷中發(fā)揮重要作用，病變彈性程度是明確乳腺病變良惡性質(zhì)的重要指標(biāo)[3-4]。前期研究證明，乳腺癌的硬度往往伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白和纖維連接蛋白的異常變化[8-10]。而Smad2/3通路作為控制膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)的主要通路[5]，其與乳腺病變的彈性特征是否相關(guān)目前卻研究較少。

表 3 SWE參數(shù)、Smad2/3、Smad2/3+“硬環(huán)征”的截?cái)嘀?、敏感度、特異性、約登指數(shù)、準(zhǔn)確度Tab. 3 Sensitivity, specificity, youden index and accuracy of the parameters of SWE, the expression level of Smad2/3 and the combination of Smad2/3 and “stiff rim sign”

本研究表明，Smad2/3的乳腺良性疾病表達(dá)率明顯低于惡性疾病，是鑒別良惡性疾病的一個(gè)重要特征。前期研究表明，Smad家族成員在多種腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，可作為某些惡性腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物[11]。Smad2/3的激活不僅可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[12]，還與胰腺癌、胃癌的不良生存有關(guān)[11,13]。在乳腺癌中，異常表達(dá)的Smad2/3在招募并極化不同類型的免疫細(xì)胞的同時(shí)，還抑制表皮生長因子誘導(dǎo)的蝸牛蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)，有利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。Gong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Smad2/3通路，可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的致瘤性和成球能力。此外，Smad2/3途徑也對血管生成擬態(tài)起調(diào)控作用，為生長中的腫瘤提供營養(yǎng)，促進(jìn)病情進(jìn)展[17]。本研究進(jìn)一步證明，Smad2/3具有區(qū)分乳腺良惡病變的診斷價(jià)值，為乳腺癌的鑒別診斷提供新的切入點(diǎn)。

既往研究表明，TGF-β1對乳腺病變的硬度起到一定的調(diào)控作用[18]。Smad2/3為TGF-β1下游細(xì)胞信號(hào)分子，其異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分積聚過度[19]。Kalinina等[5]的研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，TGF-β/Smad通路有可能影響Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈、Ⅰ型膠原蛋白的α2鏈、Ⅲ型膠原蛋白的α1鏈及結(jié)締組織生長因子的合成。前期研究也表明，Smad2和Smad3的表達(dá)不僅影響Ⅰ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅳ型膠原以及纖連蛋白mRNA的合成和分泌[5,20]，還可刺激細(xì)胞外基質(zhì)組成，抑制細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白降解(膠原蛋白和纖維連接蛋白)[21]。此外，通過Smad2/3途徑，乳腺癌中可誘導(dǎo)形成多種細(xì)胞外基質(zhì)重塑酶，提高細(xì)胞黏附，降低病變活性[22]。本研究結(jié)果顯示，Smad2/3的表達(dá)水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明了Smad2/3通路為傳導(dǎo)TGF-β1信號(hào)的主要通路，參與對乳腺病變硬度的調(diào)控。

在乳腺惡性病變中，往往伴隨結(jié)締組織的增殖反應(yīng)或癌細(xì)胞向外周組織浸潤[23]。成纖維細(xì)胞和其他祖細(xì)胞在Smad2/3誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞活性向外轉(zhuǎn)移至生長邊緣，導(dǎo)致外周硬度增加[24-25]。然而，由于液化和壞死，惡性腫瘤中心硬度相對降低，即產(chǎn)生乳腺癌特有的“硬環(huán)征”[26]。臨床結(jié)果表明，有“硬環(huán)征”的乳腺病變中Smad2/3的表達(dá)水平明顯高于無“硬環(huán)征”的乳腺病變組織中Smad2/3的表達(dá)水平，提示Smad2/3與“硬環(huán)征”具有相關(guān)性。

既往研究表明，“硬環(huán)征”具有較高的診斷效能[11,27-28]。在本研究中，盡管Smad2/3聯(lián)合“硬環(huán)征”的特異性低于“硬環(huán)征”，但其診斷敏感度和準(zhǔn)確性明顯高于“硬環(huán)征”(P < 0.05)。提示Smad2/3聯(lián)合“硬環(huán)征”可能成為乳腺癌鑒別診斷的一個(gè)新切入點(diǎn)，可提高SWE彈性指標(biāo)對乳腺癌診斷的準(zhǔn)確性，為乳腺病變的診斷提供新思路。

綜上所述，Smad2/3的表達(dá)與最大彈性模量、平均彈性模量、病灶與周圍組織彈性比值及“硬環(huán)征”相關(guān)，提示Smad2/3可能在病變彈性特征調(diào)控中起重要作用。Smad2/3聯(lián)合“硬環(huán)征”可能有助于乳腺癌的診斷。