細胞因子Irisin緩解高糖誘導骨髓間充質干細胞凋亡的機制研究

郭樹琴，焦 婷，趙立升，楊 爍，黨瑞杰，溫 寧，朱 彪北京鐵建醫院 口腔科，北京 100855； 解放軍總醫院第一醫學中心 口腔科，北京 10085； 河北大學附屬醫院 腫瘤科，河北保定 071000； 首都醫科大學附屬復興醫院 口腔科，北京 10008

隨著我國經濟的飛速發展，人們的生活方式逐漸西方化，2型糖尿病患者也隨之增多[1]。糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝性異常疾病，長期高血糖引起的晚期糖基化終末產物集聚可導致骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)細胞凋亡[2]。Irisin是最近發現的一種在棕色脂肪組織中高表達的分泌型細胞因子，其可緩解胰島素抵抗，促進胰島β細胞增殖，減少β細胞凋亡并促進胰島素的合成與分泌[3-7]。且Irisin緩解糖毒性所致細胞損傷的作用與激活AMP依 賴 的 蛋 白 激 酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路密切相關[8-9]。但Irisin對高糖環境中BMSCs細胞凋亡的影響及作用機制尚不清楚。因此，本課題擬探討高糖環境中Irisin對小鼠BMSCs細胞凋亡的作用及其機制，為深入研究I risin功能奠定基礎。

材料與方法

1 實驗材料、試劑與儀器 4周齡C57小鼠BMSCs(解放軍總醫院轉化醫學中心實驗室)；重組Irisin蛋白(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；α-MEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；AMPK特異性抑制劑Compound C、胰蛋白酶、錐蟲藍(美國Sigma公司)；青霉素及鏈霉素(石家莊華北制藥)；磷酸化(p)-AMPK抗體(貨號：AF3423，稀釋比例1∶1 000；美國Affinity公司)；AMPK抗體(貨號：Ab32047，稀釋比例1∶3 000；英國Abcam公司)；Bax抗體(貨號：Ab32503，稀釋比例1∶3 000；英國Abcam公司)；Bcl-2抗體(貨號：AF6139，稀釋比例1∶1 000；美國Affinity公司)；β-actin抗體(貨號：BM0627，稀釋比例1∶200；武漢博士德)及山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；BCA(bicinchoninic acid)測定試劑盒(武漢博士德)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore公司)。SW-CJ-1FD型CO2恒溫培養箱(蘇州集團安泰空氣技術有限公司)；BCM-1000A型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；5702R型低速離心機、Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國eppendorf公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一儀器廠)；L W300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 篩選Irisin干預濃度的劑量反應實驗 將BMSCs分為5組：對照組(Vehicle)，高糖誘導組(high glucose，HG；將α-MEM培養基中的葡萄糖濃度提高至55 mmol/L，糖濃度參考既往文獻報道[10])，低濃度Irisin組(高糖 + 50 ng/mL irisin)，中濃度Irisin組(高糖 + 100 ng/mL irisin)和高濃度Irisin組(高糖 + 200 ng/mL irisin)。復蘇凍存的BMSCs，采用含10%胎牛血清的α-MEM培養液培養1 d后，全換液。加入高糖和不同濃度的Irisin后繼續培養3 d進行錐蟲藍染色。錐蟲藍染色的步驟：取各組細胞，0.5%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液。然后采用濃度為0.4%的錐蟲藍染液進行染色。9滴單細胞懸液加1滴錐蟲藍染液混勻后鋪板，細胞計數儀檢測各組細胞的凋亡率。細胞凋亡率(%)=著色細胞/總細胞 × 100%。依據本實驗結 果選擇后續實驗Irisin的干預濃度。

3 細 胞 分 組 對 照 組(Vehicle)，高 糖 誘 導組(HG)，Irisin干預組(HG + irisin)，抑制劑組(HG +irisin + Compound C，CC；Compound C為AMPK的特異性抑制劑)。每組3個重復。復蘇凍存的BMSCs。采用含10%胎牛血清的α-MEM培養液培養1 d后，全換液。加藥后采用含高糖的α-MEM培養液(葡萄糖濃度為55 mmol/L)繼續培養3 d進行后續實驗。加藥順序：加入20 μmol/L的Compound C培養30 min后[11]，加入Irisin(未標明加 藥的組別不處理)。

4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞，0.5%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI。分別混勻，于室溫下避光孵育5～10 min后上機檢測。采用FlowJo 10.4軟件對實驗結果進行分析：左上象限(Q1)為細胞死亡百分比，右上象限(Q2)為晚期凋亡百分比，右下象限(Q3)為早期凋亡百分比，左下象限(Q4)為活細胞百 分比，細胞凋亡率=Q2 + Q3。

5 Western blotting檢測Bcl-2、Bax與p-AMPK的表達 實驗步驟參照既往文獻報道[12]：取各組細胞，PBS緩沖液沖洗3遍，加入細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各取50 μg總蛋白，上樣后進行凝膠電泳。電泳后進行220 mA、2 h的轉膜，室溫封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h。用化學發光劑染色、顯影，并采用Image J軟件分析膠片灰度。所有實驗至少重復3 次。

6 統計學處理 使用SPSS26.0軟件進行數據處理，計量資料以x±s表示。對正態分布的計量資料采用單因素方差分析，方差齊性檢驗采用Levene’s檢驗，檢驗水準α=0.1。如果方差齊采用LSD法進行進一步比較，如果方差不齊采用Tamhane’s T2法進行進一步比較。P＜0.05為差異有 統計學意義。

結 果

1 篩選Irisin干預濃度的劑量反應實驗 與Vehicle組相比，HG組BMSCs細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。Irisin干預可濃度依賴性地降低高糖環境中BMSCs的細胞凋亡率且其作用具有飽和性，故選擇100 ng/mL的Irisin作為后續實驗的干預濃度 。見圖1。

圖1 Irisin劑量反應實驗 (aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs HG組；cP＜0.05，vs 50 ng/mL組)Fig.1 Dose-response study for selecting optimum irisin intervention dose (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs HG group; cP＜0.05, vs 50 ng/mL group)

2 Irisin對高糖環境中BMSCs細胞凋亡的影響 如圖2所示，與對照組(Vehicle)相比，高糖(HG)組BMSCs凋亡比例明顯升高，而Irisin干預降低高糖環境中BMSCs的凋亡。加入AMPK特異性抑制劑Compound C后(CC組)，Irisin降低 BMSCs凋亡的作用明顯減弱。

圖2 Irisin對高糖環境中BMSCs細胞凋亡的影響 (aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs HG組；cP＜0.05，vs Irisin組)Fig.2 Effect of irisin on BMSCs apoptosis in high glucose condition (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs HG group; cP＜0.05, vs Irisin group)

3 Irisin對凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax表達的影響 如圖3所示，與對照組(Vehicle)相比，高糖(HG)組抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達比(Bcl-2/Bax)明顯降低，而Irisin干預顯著提高了Bcl-2/Bax蛋白表達比。加入AMPK特異性抑制劑Compound C后(CC組)，Irisin提高Bcl-2/B ax的作用明顯減弱。

圖3 各組細胞凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax的表達 (aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs HG組；cP＜0.05，vs Irisin組)Fig.3 Expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax(aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs HG group; cP＜0.05, vs Irisin group)

4 Irisin對p-AMPK表達的影響 如圖4所示，與對照組(Vehicle)相比，高糖組(HG) p-AMPK的表達顯著降低，而Irisin干預可逆轉高糖降低p-A MPK表達的作用。

圖4 Irisin對p-AMPK表達的影響 (aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs HG組)Fig.4 Effect of irisin on p-AMPK expression (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs HG group)

討 論

本研究發現，Irisin可緩解高糖誘導的小鼠BMSCs凋亡，提高抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達比值，Irisin的這些作用與激活AMPK有關。

細胞凋亡是在凋亡信號誘導下觸發細胞內級聯反應導致的細胞主動死亡[13]。線粒體在內源性細胞凋亡調控中居主導地位，許多Bcl-2家族成員如Bax、Bcl-2等都定位于線粒體膜[14]。Bax通過增進細胞色素C的釋放促進凋亡，故Bax也被稱作“凋亡蛋白”；與Bax的功能相反，Bcl-2通過阻止細胞色素C的釋放抑制凋亡，Bcl-2是“存活蛋白”[15]。本研究發現Irisin既能促進高糖環境中小鼠BMSCs細胞Bcl-2表達，又能抑制Bax表達，從而發揮對抗高糖誘導小鼠BMSCs細胞凋亡的作用。

AMPK是生物能量代謝調節的關鍵分子，是機體保持葡萄糖平衡所必需的[16]。同時，AMPK與細胞的自噬、增殖、分化、凋亡、衰老等過程密切相關[17]。既往研究發現，激活AMPK可對抗炎癥、高糖等環境刺激誘導的細胞凋亡[18-20]。本研究發現，Irisin不僅能提高高糖環境中小鼠BMSCs細胞Bcl-2與Bax蛋白的表達比例，還能激活AMPK。本研究通過加入AMPK特異性抑制劑Compound C來反證AMPK在Irisin緩解高糖誘導BMSCs凋亡中的作用，結果表明，加入Compound C后，Irisin提高Bcl-2與Bax蛋白表達比例的作用明顯減弱，細胞凋亡率顯著上升。這些結果表明，Irisin緩解高糖環境中小鼠BMSCs細胞凋亡的作用至少在某種程度上是通過激活AMPK實現的。與本實驗結果類似，有研究發現Irisin可通過激活AMPK對抗細菌胞壁脂多糖誘導的成骨細胞凋亡[21]。

自噬是真核細胞特有的一種細胞內降解機制，通過將損傷的細胞器或大分子蛋白降解為小分子片段并被細胞重新利用來滿足機體代謝的需要和某些細胞器的更新，在機體損傷保護中占據重要地位[22-23]。文獻報道，激活AMPK可通過增強自噬來減少細胞凋亡[24-25]，但本研究未進一步探討激活AMPK減緩細胞凋亡的具體機制，這是本文的一個局限。自噬在Irisin緩解高糖環境BMSCs細胞凋亡中的作用值得進一步研究。

綜上所述，本研究發現Irisin可在體外抑制高糖誘導的小鼠BMSCs細胞凋亡，并且Irisin的這種有益作用與激活AMPK有關。Irisin有望被開發成抑制高糖環境中BMSCs細胞凋亡的一種新型藥物。