人工膜肺用于血液回輸前一氧化氮負載的研究

趙 靜，陳 濤，李三中，侯麗宏，雷 翀

當紅細胞膜被破壞時，可釋放游離血紅蛋白（free hemoglobin，fHb），血漿中過量的fHb可引起血管內皮細胞功能障礙、血小板活化、炎癥反應、氧化損傷等不良反應，從而導致微循環障礙、肺動脈高壓、甚至肺、腎臟、腸道等器官的損傷［1－2］。其中，因fHb導致的內皮源性一氧化氮（nitric oxide，NO）耗竭是引起血管內皮功能障礙進而導致器官功能受損的重要機制［2－3］。如何降低因fHb的增加而引起的器官損傷是備受關注的臨床問題。既往的研究及本團隊前期的研究均提示，外源性的補充NO可減少fHb引起的內源性NO消耗，從而減少fHb相關的損傷［4］。臨床最為常用的外源性NO的補充方法為吸入NO氣體，然而，目前對于NO吸入的臨床獲益尚存在爭議［5］，且NO吸入治療也存在一定弊端，因此，若在血液回輸前，能在體外對于含大量fHb的血液進行NO負載后再進行回輸，理論上可以在減少fHb相關器官損傷的同時避免直接吸入NO的損害和弊端。

本研究擬通過使用體外膜肺材料對長時間心肺轉流（cardiopulmonary bypass，CPB）后回收的殘余機血進行NO負載處理，初步建立血液的NO體外負載方法模型，檢測體外膜肺材料對血液進行NO負載中的價值，探索使用人工膜肺對血液進行NO負載的有效參數，為后續的研究和臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器收集5例主動脈夾層動脈瘤行全主動脈弓置換術患者CPB結束后回收的、經肝素抗凝的殘余機血450 ml/例（總CPB時間大于3 h，回收機血中含有大量fHb）、聚丙烯（polypropylene，PP）材質氧合器5個（廣東科威）、醫用一氧化氮氣體、醫用氧氣、無菌儲血袋、一次性無菌輸血器、動脈血氣針、真空采血管、fHb檢測試劑盒（QuantichromTM Hemoglobin Assay Kit，BioAssay System）、NO治療儀（SLE3600）、血氣分析儀（GEM 4000）、低溫高速離心機（中國湘立）、酶標儀（美國biotek）、Sievers NOA 280i NO分析儀（美國GE公司）。

1.2 NO負載裝置及負載流程

1.2.1 人工膜肺的準備 使用0.9%的生理鹽水預充排氣人工膜肺并浸泡10 min，記錄預充量。以20 ml/min的流速，使用機血沖洗浸泡過的膜肺，直至人工膜肺入血口和出血口血紅蛋白濃度相等，記錄沖洗量。每次使用新的參數前均需使用相當于沖洗量的新的機血沖洗人工膜肺，以排除前一次實驗的影響。

1.2.2 相關參數的設置 本研究使用同等規格的大鼠膜肺，其膜面積恒定，NO氣體濃度恒定，通過設定不同的血液流速達到調整氣血比的目的。本研究依據輸液泵本身的泵速限制，設置四種血液流速：20 ml/min、15 ml/min、10 ml/min、5 ml/min。為研究膜面積對于負載效果的影響，本研究中使血液多次通過膜肺來擴展膜面積，每個設定流速下，血液均通過3次人工膜肺以完成NO負載。

1.2.3 裝置及負載流程（圖1） ①將所收殘余機血分為四等分，每個流速使用一份；②按照圖1連接系統，并設置血液流速，使用血液沖洗人工膜肺后，分別按設定速度和濃度同時開啟輸液泵和NO氣體，血液完全通過人工膜肺后則完成第一次NO負載，然后調換儲血袋位置使其中的血液再次以該設定速度通過人工膜肺完成第二次及第三次NO負載，該設定血液流速下的實驗完成；③調整血液流速完成其他三個設定流速下的NO負載實驗，每次更改流速設定后，均需使用新的機血以最大流速20 ml/min沖洗人工膜肺，待四個流速下的實驗均完成，該次實驗結束。

圖1 NO裝置及負載流程示意圖

1.3 血樣的采集及fHb、NO消耗檢測在每個流速時的基礎狀態（每次調整血液流速后）及每完成一遍NO負載實驗后分別采血4.5 ml用于血氣檢測及后續的fHb及NO消耗的檢測。fHb濃度檢測試劑盒按照說明書操作，使用酶標儀讀取400 nm波長的吸收度；NO消耗使用Sievers NOA 280i一氧化氮分析儀進行檢測，在玻璃反應槽中加入可持續產生穩定流量的NO氣體的NONOate，Sievers可將穩定的NO信號轉換為穩定的電信號，通過分析加入fHb標準品及含fHb血樣品后電信號的變化即可計算出每一份樣品的NO消耗。

1.4 統計學分析數據的統計分析采用SPSS 24.0統計軟件進行。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用方差分析，對NO負載后NO消耗及高鐵血紅蛋白（methemoglobin，MetHb）比例的變化趨勢使用重復測量方差分析，組間兩兩比較使用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），fHb及K＋的變化使用方差分析，P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血漿消耗NO能力及MetHb的變化不同血液流速組之間，經負載后不同時點的血漿消耗NO的能力有顯著差異（P＜0.05）（表1）。對各組NO消耗數據進行重復測量的方差分析，不同組之間進行三次負載后NO消耗的均值之間有顯著性差異（F＝2.333，P＝0.035）（圖2A）。從變化趨勢分析來看，三次負載之間均存在顯著的線性變化趨勢（F＝582.747，P＜0.01）和二次方變化趨勢（F＝7.236，P＝0.02）。不同組間的線性變化趨勢之間無顯著性差異（F＝0.805，0.515），但二次方變化趨勢顯著不同（F＝6.580，P＝0.007）。組間兩兩對比結果顯示，NO消耗隨時間的變化趨勢在20 ml/min組與15 ml/min組間無統計學差異（P＝0.692），在5 ml/min組和10 ml/min組間無統計學差異（P＝0.056），而在20 ml/min組與5 ml/min（P＜0.001）和10 ml/min（P＝0.009）組之間有顯著性差異。對于三次負載后，不同組之間NO消耗變化的差值之間無統計學差異（圖2B）。

圖2 NO負載后血中NO消耗的變化

表1 不同血液流速下血漿NO消耗的比較（μmol/L，±s）

表1 不同血液流速下血漿NO消耗的比較（μmol/L，±s）

時點 20 ml/min 15 ml/min 10 ml/min 5 ml/min F值 P值基礎值 47.25±3.62 46.14±4.93 45.20±0.79 45.48±1.13 0.344 0.794第一次負載 37.35±3.94 37.00±0.70 33.31±1.73 32.53±2.62 3.816 0.039第二次負載 27.29±0.45 31.49±1.75 27.04±0.88 22.51±4.05 10.526 0.001第三次負載 22.43±1.21 17.83±0.93 17.82±0.93 15.42±0.85 12.468 0.001

對組間各時點的MetHb比值進行方差分析，結果顯示組間有統計學差異（圖3A）。而經重復測量方差分析后所得結果與NO消耗結果類似，不同組之間進行三次負載時MetHb比例的均值之間有顯著性差異（F＝386.09，P＜0.001）。從變化趨勢分析來看，三次負載之間均存在顯著的線性變化趨勢（F＝987.429，P＜0.001）和二次方變化趨勢（F＝19.898，P＝0.001）。不同組間的線性變化趨勢和二次方變化趨勢均顯著不同（P＜0.001）。同樣經過三次NO負載后，與基礎值相比，以20 ml/min的血流速度進行NO負載后血中MetHb比例升高程度最大（升高了1.637%）。之后依次為15 ml/min（1.188%），5 ml/min（1.181%）和10 ml/min（0.944%）。

2.2 不同血液流速下fHb及K＋的變化血中fHb和K＋均有輕度增加，但不同組間各時間點的fHb和K＋并無顯著性差異，且經三次負載后分別與基礎值之間相比無統計學差異（圖3B、圖3C）。

圖3 負載過程中血漿MetHb、fHb和K＋的變化趨勢

3 討 論

既往的研究顯示，血中fHb的升高與患者并發癥的發生具有顯著相關性，而由fHb引起的血管內皮源性NO的耗竭是fHb相關不良反應的主要發生機制［2－3］。臨床診療過程中有多種發生紅細胞破壞導致fHb釋放的場景：庫存紅細胞輸注、自體血回輸、CPB、體外膜氧合治療、血液透析等［6－7］。如何降低因fHb的增加而引起的器官損傷是備受關注的臨床問題。有學者嘗試通過外源性的補充NO來減少fHb引起的內源性NO消耗，方法包括靜脈應用可持續產生NO的藥物（如L－精氨酸、硝普鈉、鳥苷酸環化酶）或具有靶向釋放NO的NO供體，但目前多處于臨床前研究階段［8－9］，相比較而言吸入NO氣體是相對常用的臨床治療方法。

本團隊前期的研究顯示，CPB心臟手術時由于紅細胞被破壞，血中fHb大幅度升高，升高的比例對于術后發生急性腎損傷有重要的預測作用，而在CPB開始時吸入持續24 h的NO可降低fHb升高導致AKI的發生率［4］。然而，目前對于吸入NO的臨床獲益尚存在爭議，其原因可能在于NO的生理作用廣泛（血管緊張度調節、凝血過程、炎癥反應和氧化作用）。因此，吸入時機、吸入時長及吸入對象的不同均可能導致不同的臨床預后［5］。事實上，進行NO吸入治療也有其弊端：首先，未接受氣管插管患者的NO吸入效率較低；其次，吸入NO需要特殊的設備，并非所有的醫療單位均可滿足；第三，由于NO和氧氣可快速反應生成有毒性的二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2），患者吸入高濃度NO2時可能造成呼吸道損傷；第四，長時間大量吸入NO可導致體內MetHb比例升高，影響氧氣輸送。因此，如果能在含fHb的血液進入機體之前降低其消耗NO的能力，理論上較全身使用NO供體或吸入NO治療更具優勢。本研究即是基于以上理論基礎的初步嘗試，結果顯示，該負載模型可有效降低血液消耗NO的能力。

本研究中建立的NO負載模型是通過使用PP材質的人工膜肺完成負載的。既往有研究顯示，NO可以通過擴散透過PP材質的人工膜肺，并且對于血小板功能具有保護性作用。而且既往的研究也顯示，接受CPB的患者在CPB開始時通過PP材質的人工膜肺吸入NO可降低其血漿消耗NO的能力，提示PP材質的膜肺對NO有一定的通透性［4］。這是本研究中選用PP材質的小動物用模式氧合器的根據，該氧合器具有預充量小（約10 ml）、參數已知、制作工藝成熟等優點，在本研究中的應用可減少實驗用血液的損耗、并可為開發適用于NO負載處理的氣體交換裝置的參數設置提供可靠參考。人工膜肺內含并列的PP材質的中空纖維集束，氣體小分子可自由通過該中空纖維膜。中空纖維集束與膜肺外壁形成相互隔離的氣路和血路，當可溶性或可被血液吸收的氣體通過浸泡于血液中的中空纖維膜時，通過彌散作用穿過纖維膜到達血液，血中高濃度的氣體小分子也可通過中空纖維膜釋放逸出，達到氣體交換的目的。使用人工膜肺進行NO負載相較于直接將NO氣體通入血液完成負載有以下優勢：①避免造成血液的污染；②避免氣體直接通入血液產生泡沫；③避免因需要使用消泡劑增加輸血的不安全因素；④避免直接通氣時因氣泡產生的溶血。

理想的負載模型理論上應該具有可快速負載、不增加血液破壞、可進行無菌處理、不需在血液中添加除NO之外的其他物質即可對血液進行按需負載等特點。本研究中使用的人工膜肺的負載效率與該材質對于NO氣體的交換效率有關。而交換效率與其材質、氣血比及交換膜面積有關。本研究中所用膜肺本身已經過無菌處理，其對血液進行NO負載時僅靠氣體的彌散通過膜肺進入血液，而不需在血液中添加其他物質，已經滿足以上特點中的兩點。本研究擬通過實驗來對該負載模型的負載效率和安全性進行檢測。在本研究中，膜肺的材質和膜面積固定，選擇使用固定的NO氣體濃度，僅通過改變血流速度來改變氣血比，通過增加血液流過膜肺的次數來擴展膜面積，這種方法不僅可節約用血，提高膜肺及血液的利用率，更為之后更為詳細的參數計算帶來便利。本研究的結果顯示，無論血液以哪種速度通過膜肺，通過次數對NO消耗的下降均有顯著影響，負載后NO消耗的變化呈線性或二次方變化趨勢，NO消耗隨通過次數的增加迅速下降，通過次數代表了膜面積，該結果說明通過擴展膜面積可顯著提升該模型的負載效力，或者對于有大量紅細胞被破壞的血液，如長時間CPB、體外膜氧合（ECMO）或透析時可以通過增加血液在該模型中的轉流次數來對血液中fHb進行NO負載，進而減少fHb引起的器官損傷。

不同的血液流速對于NO負載的效力也有一定影響，現有模型中的四種流速相比，進行三次NO負載后，血中NO消耗在5 ml/min的血流速度下下降最多，而20 ml/min的血流速度下下降最少，但組間并無統計學差異。以上結果提示，現有負載模型中，雖然5 ml/min的速度負載效力更高，但進行三次負載的效果與20 ml/min的速度下進行三次負載的效果并無統計學差異，因此，在負載效果無統計學差異的情況下，使用20 ml/min的血流速度可大大提升NO的負載速度，以更好的應對各種緊急用血的臨床情景。從安全性考慮，無論以哪種血流速度進行負載，該負載模型處理后的血液中fHb和K＋濃度均有升高，但三次負載后與負載前以上結果并無顯著性差異，該結果提示，此負載模型可能增加溶血，但僅進行三次負載時引起的溶血程度很輕，與基礎值之間無統計學差異，不同血液流速之間也無統計學差異。從血中MetHb升高的程度來看，不同組間MetHb的上升趨勢有所差別。MetHb比例的升高會使氧離曲線左移，從而影響氧的釋放，據文獻報道，MetHb在高于10%～20%時可能引起紫紺，35%～40%會導致頭痛、疲勞、頭暈和呼吸困難，高達60%～70%可能導致癲癇發作、心律失常、循環衰竭甚至死亡［10］。在本模型中，血液經NO負載后其中MetHb的比例均增加，不同組間相比，以20 ml/min的血流速度進行三次負載后MetHb比例升高的程度最高，但是，其最高值依然低于3%，遠低于前述的臨床危急值。以上結果提示，使用該模型對血液進行負載時所引起的MetHb的升高不會引起不良的臨床效應，即使在大量輸血的情況下亦可滿足安全性條件。綜合以上結果，在本負載模型中，推薦使用20 ml/min的血流速度對血液進行NO負載，負載速度更快，效率更高，并可滿足臨床的安全性要求。然而，本研究中所設血流速度受限于所使用微量泵的極限速度，是否更高的血流速度可以更高效的完成負載會在后期改良實驗設備后進一步探索。

目前有關NO體外預負載的研究相對較少，但是有關內皮模擬表面的研究近年已然興起，其主要目的是開發具有可持續釋放NO功能的涂層材料或方法，如接觸血液的材料［11］、人工血管或血管內支架，此類研究的目的也是通過外源性的補充NO以彌補因各種原因受損的血管內皮功能，而本研究目標是建立NO體外負載模型，在可能損傷血管內皮功能的血液進入機體之前通過預處理以降低其對內皮功能的損害，本模型中所用材料與設備均是已投入臨床應用的成熟產品，較新材料的開發更易實現。

綜上所述，本研究中所建立的使用PP材質的人工膜肺材料進行血液回輸前的NO負載模型可有效用于含大量fHb的紅細胞制品的體外NO負載，負載后可顯著降低血液消耗NO的能力，但是負載過程可能會導致輕微的紅細胞破壞。人工膜肺材料對fHb進行NO負載的效率與氣血比和膜面積有關，現有模型中20 ml/min的血流速度優于較低血流速度下的NO負載。