除草活性菌株HZ-011發酵培養基篩選及其條件優化

藺澤榮 朱海霞

摘要：【目的】明確除草活性菌株HZ-011的發酵培養基各因素配比及最適發酵條件，為該菌作為除草劑的研發和農田應用提供理論依據。【方法】以產孢量為目標，通過固體培養基篩選確定菌株HZ-011生長的基礎培養基;采用單因素試驗優化菌株HZ-011的發酵培養基和最佳發酵條件;利用中心組合設計（Central composite design，CCD）原理對菌株HZ-011的液體培養基成分及配比進行優化;通過響應面法分析培養基各成分間的交互作用;用菌株HZ-011發酵液對盆栽雜草（藜、密花香薷、冬葵和反枝莧）進行致病性試驗。【結果】經過優化，菌株HZ-011的培養基最佳配比為蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K2HPO4 0.428 g/L，最佳發酵條件為pH 7、溫度25 ℃、培養時間5 d、裝液量180 mL和轉速180 r/min。盆栽試驗結果表明，菌株HZ-011對藜和反枝莧全部致死，對密花香薷的致病率為75%，對冬葵的致病率為40%。【結論】優化后的培養基提高了菌株HZ-011的產孢量，為該菌株應用于農田雜草生物防治打下基礎。

關鍵詞： 菌株HZ-011;除草活性;發酵條件;單因素;產孢量;響應面

中圖分類號： S451.1;S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1931-11

Screening of fermentation medium for herbicidal active strain HZ-011 and optimization of its conditions

LIN Ze-rong1，2，3，4， ZHU Hai-xia2，3，4*

（1Qinghai University， Xining， 810016， China; 2Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Xining? 810016， China; 3Xining Crop Pest Scientific Observation and Experiment Station of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xining? 810016， China; 4Qinghai Provincial Key Laboratory of Comprehensive Management of

Agricultural Pests， Xining? 810016， China）

Abstract：【Objective】Todetermine the ratio of various factors of the fermentation medium and the optimal fermentation conditions of strain HZ-011 that has herbicidal effect on weeds， andprovide theoretical basis for development of HZ-011 herbicide and application in farmland. 【Method】The basic medium for the growth of strain HZ-011 was selected by solid medium with the goal of spore production. Single factor experiment was used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of strain HZ-011. The liquid medium composition and ratio of strain HZ-011 were optimized by using the principle of central composite design （CCD）. The interaction between the components of the medium was analyzed by response surface methodology. The pathogenicity of potted weeds（Chenopodium album， Amaranthus retroflexus， Elsholtzia densa and Malva crispa） was tested with HZ-011 fermentation broth. 【Result】After optimization， the optimal proportion of culture medium of strain HZ-011 was sucrose 48.744 g/L， peptone 15.626 g/L， NaCl 0.214 g/L and K2HPO4 0.428 g/L. The optimum fermentation conditions were pH 7， temperature 25 ℃， culture time 5 days， liquid loa-ding 180 ml and rotating speed 180 r/min. The results of pot experiment showed that strain HZ-011 killed all C. album and A. retroflexus， and the pathogenicity of E. densa was 75%， then the pathogenic rate of winter sunflower was 40%. 【Conclusion】The optimized medium increased the spore production of strain HZ-011， which lays a foundation for the application of the strain in the biological control of farmland weeds.

Key words： strain HZ-011; herbicidal activity; fermentation conditions; single factor; sporulation; response surface

Foundation item： Qinghai Applied Basic Research Project（2019-ZJ-7057）

0 引言

【研究意義】雜草是田間病蟲害傳播和寄居的主要介質，雜草增加了農田管理的勞動成本，并與作物爭資源，是影響作物產量和品質的主要生物因素（陳世國和強勝，2015;李香菊，2018;周挺等，2020）。目前，農田以化學農藥為主導的植物病蟲草害防治帶來的農藥殘留超標、病蟲草抗藥性增強及破壞生態平衡等問題逐漸加劇（Behnam et al.，2007;Ongena and Jacques，2008;Figueroa-López et al.，2016），而微生物防治雜草表現出的無污染、無公害、長效性、易人工培養和寄主專一等優勢（霍沁建等，2007;林英等，2014;吳翔等，2019;朱海霞和馬永強，2020），使得生防技術成為控制田間雜草的最佳選擇（Che et al.，2018;Dong et al.，2018）。本課題組前期在自然感病的巴天酸模葉片中分離得到一株葡萄孢屬（Botrytis）真菌HZ-011，在篩菌過程中發現其對藜、密花香薷、反枝莧和冬葵等有致病效果，因此，明確菌株HZ-011的最佳發酵培養基及最適發酵條件，可為菌株HZ-011應用于雜草的生物防治提供科學依據。【前人研究進展】前人在生物防治雜草方面取得了一些研究成果。霍達等（2017）在自然感病的小飛蓬葉片中分離到分枝桿菌屬菌株XFP-9，該菌株發酵液對黑麥草（Lolium perenne L.）和歐洲菊苣（Cichorium intybus L.）種子萌發的抑制率均可達90%以上。晶雪（2017）研究發現，菌株AM-8和AM-17的發酵液對豚草幼苗具有明顯的抑制效果，且菌株AM-17對繁縷幼苗的須根數產生明顯的抑制作用。郭冉（2019）研究發現，具有除草活性的Ha1菌株發酵液與化學除草劑復配對雜草馬唐、稗草和苘草有較好的防除效果。馬永強和朱海霞（2019）發現菌株GD-9發酵液對野燕麥具有較好的致病效果，對野燕麥種子發芽的抑制率達90.1%。田媛媛（2019）研究發現，菌株NEAU-240的發酵液稀釋100倍后對盆栽稗草、反枝莧和狗牙草的主根抑制率大于90%，對莖的抑制率大于30%。吳志美等（2019）采用單因素試驗和正交試驗對除草活性成團泛菌ZLSY20菌株進行發酵條件優化，在發酵時間24 h、培養溫度32 ℃、pH 8、接菌量0.05%、通氣量20 mL/250 mL、轉速200 r/min的條件下菌株生長最好。楊瑩等（2019）采用單因素試驗和響應面法對出芽短梗霉菌PA-2菌株的液體培養基進行優化，在最佳發酵條件下提高了產孢量，并對雜草藜的鮮重防效達75.0%。梁玎玎（2020）研究發現，草莖點霉SYAU-06發酵制備水乳劑對盆栽3～4葉期的鴨拓草防效達51.38%，田間施藥21 d后的鮮重防效達50.78%。張奇等（2020）從桉樹根際土壤中篩選出一株能產生伶香豆酸、檸檬醛和胡椒堿化感物質結構類似物的真菌，使得該菌株發酵液具有很強的抑草效果。【本研究切入點】葡萄孢屬菌株大多以病原物的形式危害作物，而用于生防除草的研究僅有少量報道。【擬解決的關鍵問題】以前期從自然感病的巴天酸模葉片中分離得到的具有除草活性的真菌菌株HZ-011為材料，以產孢量為目標，篩選菌株HZ-011的基礎培養基，采用單因素試驗和響應面試驗優化菌株HZ-011的發酵培養基和最佳發酵條件，為該菌作為除草劑的研發和農田應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 供試菌種

菌株HZ-011從自然感病的巴天酸模中分離獲得，經鑒定確定為葡萄孢屬真菌，保存在青海省農林科學院植物保護研究所有害生物綜合防治實驗室。將實驗室保存的菌株HZ-011接種到PDA培養基中，于25 ℃條件下培養5 d，用于試驗。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 固體培養基篩選 從7種培養基（表1）中篩選菌株HZ-011生長的基礎固體培養基。取活化的菌種打菌餅（Φ=8 mm），接種于各培養基中央，置于25 ℃的恒溫培養箱中培養，培養2和4 d后測量菌落直徑，并觀察菌株HZ-011在7種培養基中的菌落形態，重復3次。選擇菌落直徑較大的培養基為固體基礎培養基。

1. 2. 2 液體培養基篩選 取活化的菌種打菌餅（Φ=8 mm）接種于7種液體培養基中，每50 mL接1塊菌餅，于25 ℃條件下170 r/min搖床培養，在發酵培養的第1、2、3、4、5、6和7 d分別測定產孢量，重復3次。選擇產孢量較大的培養基為優化的基礎培養基。

1. 2. 3 培養基優化單因素試驗 將培養基中活化的菌餅接種于基礎培養基培養液中（250 mL三角瓶），于25 ℃條件下170 r/min搖床培養7 d，采用分光光度法測定菌液在640 nm波長處的OD值，重復3次。培養基成分及水平見表2。

1. 2. 4 培養基成分及配比優化 根據中心組合設計原理，對主要因素碳源、氮源及無機鹽的配比進行優化，以單因素試驗結果為中心點，菌株HZ-011的OD值為響應值（Y），設計3因素3水平的響應面試驗（表3）。

1. 2. 5 發酵條件優化試驗 以優化的培養基為發酵培養基，分別測定不同初始發酵時間（1、2、3、4、5、6和7 d）、裝液量（100、120、140、160、180、200和220 mL/瓶）、培養溫度（15、20、25、30和35 ℃）、pH（5、6、7、8和9）和搖床轉速（140、160、180、200和220 r/min）對菌株HZ-011 OD值的影響，每處理3次重復。

1. 3 菌株HZ-011對雜草的致病作用

將田間8～9葉期正常生長的藜、冬葵、密花香薷和反枝莧移栽至花盆（Φ=15 cm），于溫室內培養。每盆接種25 mL濃度為1.0×105～1.0×107個/mL的菌株HZ-011發酵液，加入0.4%吐溫20。接種后的雜草植株置于室溫，用JBX-3.5離心式工業加濕器保持相對濕度為60%，12 h光暗交替培養。培養7 d后調查雜草發病程度，計算發病率。

1. 4 統計分析

采用Excel 2010、Design Expert 11和DPS 9.01對試驗數據進行統計分析，運用新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 培養基優化結果

2. 1. 1 固體培養基篩選 由表4和圖1可知，菌株HZ-011在PDA培養基、培養基Ⅰ、培養基Ⅱ和察氏培養基中營養菌絲發達，產生黃色色素;在孟加拉紅培養基和燕麥片培養基中氣生菌絲發達，呈雪花狀;在培養基Ⅲ中氣生菌絲不發達，邊緣整齊。

菌株HZ-011在7種培養基中的菌落直徑大小見表5。培養2 d后，菌株HZ-011在PDA培養基中的菌落直徑最大，為4.52 cm，其次為培養基Ⅰ和培養基Ⅲ，菌落直徑分別為4.34和4.20 cm，三者間菌落直徑差異不顯著（P>0.05，下同）;孟加拉紅培養基中的菌落直徑最小，為2.00 cm，顯著小于其他6種培養基中的菌落直徑（P<0.05，下同）。培養4 d后，菌株HZ-011在培養基Ⅰ中的菌落直徑最大，為7.52 cm，其次為培養基Ⅱ，菌落直徑為7.24 cm，二者間菌落直徑差異不顯著;燕麥片培養基中的菌落直徑最小，為3.42 cm，顯著小于在PDA、培養基Ⅰ、培養基Ⅱ和培養基Ⅲ中的菌落直徑。

2. 1. 2 液體培養基篩選 由表6可知，菌株HZ-011在培養基Ⅰ中培養第5 d時的產孢量最大，為45.40×106 個/mL，明顯高于在其他培養基中的產孢量，因此，結合菌落的形態特征和直徑大小，選擇培養基Ⅰ為菌株HZ-011的產孢培養基。

2. 2 培養基優化單因素試驗結果

2. 2. 1 蔗糖 由圖2可知，隨著蔗糖含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，當蔗糖含量達50 g/L時的OD值最大，與其他蔗糖含量的OD值間差異顯著，隨后緩慢下降。因此，選擇初始蔗糖添加量50 g/L為菌株HZ-011發酵的最適碳源量。

2. 2. 2 蛋白胨 由圖3可知，隨著蛋白胨含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降再緩慢上升，當蛋白胨含量達15 g/L時的OD值最大，與其他蛋白胨含量的OD值間差異顯著。因此，選擇初始蛋白胨添加量15 g/L為菌株HZ-011發酵的最適氮源量。

2. 2. 3 K2HPO4 由圖4可知，隨著K2HPO4含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后緩慢下降，當K2HPO4含量達0.4 g/L時OD值達最大，且與其他K2HPO4含量的OD值間差異顯著。因此，菌株HZ-011發酵培養基的最佳K2HPO4含量為0.4 g/L。

2. 2. 4 NaCl 由圖5可知，隨著NaCl含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，再上升后緩慢下降，當NaCl含量達0.2 g/L時OD值達最大，且與其他添加量的OD值間差異顯著。因此，菌株HZ-011發酵培養基的最佳NaCl含量為0.2 g/L。

2. 3 中心組合試驗優化結果

根據單因素試驗結果，對菌株HZ-011的液體培養基條件，利用Design Expert 11的CCD設計原理進行3因素3水平試驗設計，結果見表7。

以菌株HZ-011發酵培養基OD值（Y）為響應值，根據中心組合試驗結果，對表7數據進行分析，得到OD值與蔗糖（A）、蛋白胨（B）和無機鹽（C）的二次多項回歸方程：Y=-4.8069+0.1498A+0.1950B+2.1420C-0.0006AB-0.0043AC+0.0225BC-0.0014A2-0.0057B2-1.7794C2。

對回歸模型進行方差分析和可信度分析，結果見表8。模型的F=55.37，P<0.0001，說明該回歸方程極顯著（P<0.01，下同）;失擬項不顯著，說明該模型模擬性較好;模型的復相關系數R2=0.9861，調整復相關系數R2=0.9683，預測復相關系數R2=0.8368，調整復相關系數與預測復相關系數的差值小于0.2，說明該模型具有較好的回歸性;模型信噪比>4，表明該模型具有足夠的信號響應設計。因此，該模型能對菌株HZ-011的OD值進行分析和預測。

模型數據顯示，一次項A、B、C和交互項BC影響顯著，二次項A2、B2、C2影響極顯著，各因子的影響主次順序為C>A>B>BC>AB>AC。

利用Design Expert 11制作試驗因素間交互效應三維立體響應面和等高線圖，在確定1個因素的情況下，觀察其他2個因素對OD值的影響，結果如圖6～圖8所示。蔗糖含量、蛋白胨含量和無機鹽含量三者交互作用響應面具有較好的對稱性，均開口向下，且交互效應的等高線形狀為圓形，說明三者存在交互作用。根據回歸方程得到菌株HZ-011發酵培養基產孢量的培養基條件為： 蔗糖48.744 g/L，蛋白胨15.626 g/L，無機鹽0.642 g/L（其中NaCl 0.214 g/L，K2HPO4 0.428 g/L），預測菌株HZ-011的OD值最大為0.952。

根據模型求出的培養基最優條件配比進行3次以上試驗驗證，菌株HZ-011的平均OD值為0.893。與預測值差異較小，原因可能是培養基在發酵過程中外界條件的影響或孢子數的變化引起轉速、溫度和含氧量發生變化所致，說明該模型可用于優化菌株HZ-011的培養基。

2. 4 培養基發酵條件優化結果

2. 4. 1 時間 由圖9可知，菌株HZ-011的OD值隨發酵時間的延長呈先上升后緩慢下降的變化趨勢，在發酵第5 d時OD值達最大，且顯著高于其他發酵時間的OD值。因此，菌株HZ-011在培養基上的最適發酵時間為5 d。

2. 4. 2 裝液量 錐形瓶中裝液量不同引起菌株HZ-011的OD值不同。由圖10可知，菌株HZ-011的OD值隨裝液量的增加呈先下降后上升再下降的變化趨勢，當裝液量為180 mL時OD值達最大，且顯著高于其他裝液量的OD值。因此，選擇180 mL為菌株HZ-011的最適裝液量。

2. 4. 3 溫度 由圖11可看出，在發酵溫度為15～25 ℃時，菌株HZ-011的OD值呈上升趨勢，25 ℃時OD值達最大，發酵溫度超過25 ℃后OD值快速下降。因此，選擇25 ℃作為菌株HZ-011發酵的最佳溫度。

2. 4. 4 pH 由圖12可知，菌株HZ-011的OD值隨pH的增大呈先上升后下降的變化趨勢，當pH=7時OD值達最大，pH>7時OD值開始下降。因此，pH 7為菌株HZ-011發酵的最佳pH。

2. 4. 5 搖床轉速 由圖13可知，當搖床轉速為140～180 r/min時菌株HZ-011的OD值呈上升趨勢，在180 r/min時達最大值，當轉速超過180 r/min后OD值緩慢下降。因此，選擇180 r/min作為菌株HZ-011發酵的最佳搖床轉速。

2. 5 菌株HZ-011對雜草的致病作用

對雜草接種優化后菌株HZ-011的發酵液，結果見表9。接種1 d后，藜葉片出現病斑，葉緣卷曲;反枝莧葉片萎蔫，葉緣干枯;冬葵從根部往上的葉片逐漸開始發黃;密花香薷有零星小病斑，無明顯萎蔫現象。接種4 d后，藜有一半的葉片萎蔫并且枯死，發病率達51%;反枝莧接近2/3的葉片失綠呈現褐色，部分葉片枯死;冬葵25%的葉片變黃色;密花香薷35%的葉片葉緣干枯，葉片產生褐色斑點。接種7 d后，藜和反枝莧葉片全部死亡;密花香薷有75%的葉片枯死;冬葵只有40%的發病率，且癥狀為整片葉的一半發黃。

3 討論

葡萄孢屬真菌是很少見的生防除草菌，本研究中的葡萄孢屬真菌HZ-011分離于自然感病的巴天酸模葉片。菌株HZ-011對青海省主要作物青稞、小麥、豌豆和油菜均無致病作用;優化后的菌株HZ-011發酵液對盆栽雜草藜和反枝莧可達到100%的致病效果;對密花香薷的致病率為75%;對冬葵的致病率為40%，是一株具有除草活性的菌株。

微生物除草劑是通過孢子侵入雜草氣孔并破壞氣孔組織從而發揮致病作用。而孢子是微生物發酵過程中的一個中間體，其質量、數量和發酵產量均受發酵條件和環境的綜合影響（許麗娟等，2008）。研究微生物發酵所需的培養基配方和發酵條件是提高產孢量的重要途徑（苗莉云等，2013;李浩浩等，2018;周春元等，2019）。培養基成分對生物量的多少和粗提物的產量均有影響（劉寧等，2009）。通過培養基和發酵條件優化來提高孢子產量，可為工業化生產和應用生防菌劑提供保障（Sharifyazda and Karim，2017）。利用植物病原菌除草可減少農藥的使用及對環境的污染。

碳源占微生物細胞干物質的51%，而氮源的主要功能是構成微生物細胞和含氮代謝產物，有些氮源物質可參與活性物質前體的合成，有些代謝產物可起到特殊的調節作用（劉寧等，2009）。氮源微生物發酵受多種生物和非生物因子的影響，發酵時間、裝液量、初始pH、培養時間和培養溫度等因素是發酵過程中極為關鍵的控制和檢測參數，可直接影響菌體生長和產物合成（Liu et al.，2015;Zhao et al.，2016;Kot et al.，2017;蔣晶晶等，2019）。本研究發現蔗糖最有利于葡萄孢屬真菌HZ-011產孢，葡萄糖也能促進產孢，與杜艷麗等（2019）的研究結果一致;蛋白胨作為氮源可提高菌株產孢量，與楊瑩等（2019）的研究結果一致;無機氮源不利于孢子形成，與高智謀等（2009）的研究結果一致;K2HPO4和NaCl中的陰陽離子可調節細胞的滲透壓，作為某些酶的輔助因子維持細胞功能（張艷等，2006），可間接促進代謝物的產生。

在發酵條件優化試驗中，葡萄孢屬真菌HZ-011在中性條件下生長最快，與尹艷楠等（2020）的研究結果相似。菌株HZ-011的最適發酵時間為5 d，比朱海霞等（2017）研究結果中多孢木霉HZ-31的發酵時間短，究其原因可能是菌株HZ-011的生長周期較多孢木霉HZ-31的短。菌株HZ-011在25 ℃條件下生長，產孢量最大，與李聰麗等（2017）的研究結果相似，在20～25 ℃下生長產孢量最大。本研究還發現，常溫下當轉速為180 r/min、裝液量180 mL時，菌株HZ-011的產孢量最大。本研究僅以菌落直徑和OD值為指標來反映菌株HZ-011的孢子量，具有一定的局限性，今后應進一步研究各因素對孢子萌發和菌核形成等的影響。對于菌株HZ-011的發酵工藝而言，最適的優化配方和條件是發酵的理論基礎，但是否滿足工業生產和田間雜草防除還需要大量的發酵數據來驗證。

4 結論

菌株HZ-011的培養基最佳配比為蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K2HPO4 0.428 g/L;最佳發酵條件為pH 7、溫度25 ℃、培養時間5 d、裝液量180 mL和轉速180 r/min。優化后的培養基提高了菌株HZ-011的產孢量，為該菌株應用于農田雜草生物防治打下基礎。

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（責任編輯 麻小燕）