廣西劍麻黑斑病病原菌鑒定及其生防菌篩選

王麗萍 陳濤 方石桂 施國駒 陳祿 龍凌云 黃秋偉 黃惠芳 毛立彥 謝紅輝

摘要：【目的】分離、鑒定一種在廣西劍麻葉片上產生圓形、近圓形或長橢圓形黑色凹陷斑塊病害的病原菌，并針對該病原菌篩選具有較好防治效果的生防菌，為病害防治提供科學依據。【方法】從廣西5個劍麻種植農場采集具有圓形、近圓形或長橢圓形黑色凹陷斑塊的病葉，采用組織分離法分離病原菌;采用葉片針刺法接種，進行病原菌致病性測定;通過病原菌形態特征觀察和分子生物學方法鑒定病原菌。采用平板對峙培養法和載玻片孢子萌發法研究哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株GZ-5、深綠木霉（T. atroviride ）菌株ST-1、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株B11和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株YZ14-3對劍麻黑斑病病原菌菌絲生長和孢子萌發的抑制效果。【結果】從病葉組織中分離出6種真菌，其中編號為JMHB1的菌株分離率最高，達96%;致病性測定結果表明菌株JMHB1為致病菌;依據形態特征和分子生物學方法，將菌株JMHB1鑒定為新暗色柱節孢（Neoscytalidium dimidiatum）。對峙培養結果顯示，生防菌菌株B11和YZ14-3可顯著抑制菌株JMHB1的菌絲生長（P<0.05），抑菌圈半徑分別為12.14和13.22 mm，且2株生防菌株的培養濾液均可導致菌株JMHB1的菌絲隘縮、斷裂;生防菌菌株ST-1和GZ-5對菌株JMHB1的拮抗系數為Ⅲ級和Ⅳ級，但其培養濾液對菌株JMHB1的菌絲無抑制作用。菌株JMHB1的孢子可在菌株YZ14-3、B11、ST-1和GZ-5的培養濾液中的萌發，萌發率分別為31.67%，32.37%，68.63%和76.63%。【結論】引起廣西劍麻葉片產生圓形、近圓形或長橢圓形黑色凹陷斑塊病害的病原菌為新暗色柱節孢[N. dimidiatum （Penz.） Crous & Slipper]，這是我國首次報道新暗色柱節孢侵染劍麻引起黑斑病。病害名稱暫定為劍麻Neoscytalidium黑斑病。劍麻生產上可選擇和搭配使用解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、深綠木霉及其商品制劑防治劍麻Neoscytalidium黑斑病。

關鍵詞： 劍麻黑斑病;新暗色柱節孢;生物防治;廣西

中圖分類號： S432.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1912-11

Pathogen identification and biocontrol microbes screening of sisal black spot in Guangxi

WANG Li-ping1， CHEN Tao1， FANG Shi-gui2， SHI Guo-ju3， CHEN Lu2， LONG Ling-yun1， HUANG Qiu-wei1， HUANG Hui-fang1， MAO Li-yan1， XIE Hong-hui1*

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning? 530001， China; 2 Guangxi State Farms Dongfang Farm Co.， Ltd.， Qinzhou， Guangxi? 535319， China; 3 Guangxi State Farms Xinguang Farm Co.， Ltd.， Qinzhou， Guangxi? 535400， China）

Abstract：【Objective】To isolate and identify the pathogen that caused round， subround or long oval hollow black spots on sisal leaves in Guangxi， and to screen out biocontrol microbes with better control effect on the pathogen， and provide scientific basis for the control of this disease. 【Method】The diseased leaves with round， subround or long oval hollow black spots were collected from 5 farms in Guangxi. The pathogen was isolated by tissue isolation method. The pathogenicity of pathogen was determined by leaf acupuncture inoculation. The pathogen was identified by observing morphological characteristics and molecular biological methods. The inhibitory effects of Trichoderma harzianum GZ-5， T. atroviride ST-1， Bacillus subtilis B11， B. amyloliquefaciens YZ14-3 and their filtrate on mycelial growth and spores germination of the pathogen were studied by plate confrontation? culture method and slide spore germination method. 【Result】Six kinds of fungi were isolated from diseased tissues，the isolation rate of strain JMHB1 was the highest（96%）. JMHB1 was the pathogenic bacteria according to the pathogenicity test， which was identified as Neoscytalidium dimidiatum based on morphological characteristics and molecular identification. Biocontrol strains B11 and YZ14-3 could significantly inhibit the mycelia growth of JMHB1（P<0.05） according to plate confrontation culture method， the radius of inhibition zone were 12.14 mm and 13.22 mm respectively， and their culture filtrates could lead to constriction and break of JMHB1 mycelia. The antagonistic coefficients of ST-1 and GZ-5 against JMHB1 were Ⅲ and Ⅳ respectively， but their culture filtrates had no inhibition effects on JMHB1 mycelia. Spores of JMHB1 could germinate in the culture filtrates of strains YZ14-3， B11， ST-1， GZ-5， the spore germination rates were 31.67%， 32.37%， 68.63%， and 76.63%， respectively. 【Conclusion】The pathogen that causes round， subround or long oval hollow black spots on sisal leaves in Guangxi is identified as N. dimidiatum （Penz.） Crous & Slipper. This is the first report of sisal black spot caused by N. dimidiatum in China. The disease is temporarily named as Neoscytalidium black spot. B. amyloliquefaciens， B. subtilis， T. atroviride and their commercial preparations can be selected and used to control Neoscytalidium black spot disease in sisal production.

Key words： sisal black spot; Neoscytalidium dimidiatum; biocontrol; Guangxi

Foundation item： National Hemp Plants Industry Technology System Construction Project（CARS-16-S14）;Project of Agricultural Reclamation Bureau of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（18210015）

0 引言

【研究意義】劍麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）主要在熱帶地區栽培，為龍舌蘭科龍舌蘭屬（Agave）多年生肉質旱生草本植物，也是一種具有重要經濟價值的硬質葉纖維作物，其纖維被廣泛應用于漁業、航海、工礦、運輸、油田等行業（陳士偉和李棟宇，2016），劍麻渣可用作飼料、肥料，還可用于生物制藥領域（Pereira et al.，2017）。廣西、廣東、海南、福建及云南等是我國劍麻主產區（汪佳濱，2016）。據統計，2018年我國劍麻種植面積約2.13萬ha，纖維總產量8.17萬t（孫娟等，2020）。近10年來，受病蟲害和自然災害頻發以及勞動力不足等因素影響，我國劍麻種植面積總體呈下降趨勢（孫娟等，2020）。病害是導致劍麻葉片產量和纖維質量下降的主要原因之一。2019年，本課題組在廣西的劍麻園中發現一種葉部病害，其癥狀為在葉片上形成圓形、近圓形或長橢圓形黑色斑塊，病部中央稍凹陷，有時有紅褐色至黑色膠狀分泌物，病健交界處紅褐色至黃色，病斑可穿透葉片，病部葉肉組織及纖維變紅褐色至黑色壞死，病部纖維易斷裂，嚴重降低纖維的質量和商品價值。經查閱國內外劍麻病害相關文獻資料，未發現有關于該類癥狀病害的報道。為此，分離、鑒定該病害的病原菌并篩選出對其抑制效果好的生防菌對于科學、有效防治該病害具有重要意義。【前人研究進展】20世紀60年代初開始有關于劍麻斑馬紋病的報道（Clinton and Peregrine，1963）。1970年，劍麻斑馬紋病在我國廣東省東方紅農場發生，并逐漸暴發流行（張燕梅等，2016）。從20世紀90年代至今，我國陸續有學者調查劍麻病害發生情況，記載的劍麻病害主要有莖腐病、斑馬紋病、紫色卷葉病、條紋病、炭疽病、褐斑病、黑斑病、葉斑病、潰瘍病、根結線蟲病及各種缺素病害等（周少霞，1998;謝紅輝等，2012;王會芳等，2018）。趙艷龍等（2007）描述了一種劍麻黑斑病，其主要癥狀為葉面散生黑色小斑點，圓形，下陷，病斑可貫穿葉片，但未說明該病害的病原種類。王會芳等（2018）報道了一種由蒂腐色二孢（Diplodia natalensis）引起的劍麻黑斑病，其主要癥狀為葉片上出現近橢圓形小病斑，后期病斑邊緣黑褐色，中間灰白色，病斑可貫穿葉面。劍麻莖腐病的病原菌除了黑曲霉（Aspergillus niger）外，Duarte等（2018）研究發現威氏曲霉（A. welwitschiae）也能侵染劍麻引發莖腐病。劍麻莖腐病、斑馬紋病和紫色卷葉病是劍麻生產上發生面積大、為害較為嚴重的三大病害（趙艷龍等，2020）。劉巧蓮等（2010）通過菌絲生長速率法研究了55%敵克松可濕性粉劑等13種化學藥劑對劍麻斑馬紋病菌煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）的抑制效果，發現68%精甲霜·錳鋅可濕性粉劑、55%敵克松可濕性粉劑和70%甲基托布津可濕性粉劑的抑菌效果最好。田間試驗結果表明，55%敵克松可濕性粉劑和70%甲基托布津可濕性粉劑對劍麻斑馬紋病的防治效果達85%以上，可在生產上推廣使用（鄭金龍等，2011）。鄭金龍等（2012）對比了6種殺菌劑對劍麻莖腐病的田間防治效果，發現50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑和10%苯醚甲環唑水分散粒劑的防治效果達60%上。劍麻紫色卷葉病由新菠蘿灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipes）引起，研究發現通過噴施48%毒死蜱800倍液+畝旺特2800倍液控制新菠蘿灰粉蚧為害，可有效降低紫色卷葉病的發病率（趙艷龍等，2020）。由于劍麻葉片的蠟質層厚，化學藥劑較難附著或滲透至葉片內部，致使藥效時間短。近幾年來，陸續有關于劍麻病害生物防治的研究報道。秦士維（2017）研究發現，葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）對黑曲霉菌菌絲生長的抑制效果達76%以上。Magalhaes等（2017）從沙丘落葉層中分離出16株伯克氏菌（Burkholderia sp.），其揮發性有機化合物對黑曲霉菌菌絲生長的抑制率達72%以上，參試菌株的田間防治效果達54%～76%。Barbosa等（2018）研究了類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）、短桿菌（Brevibacterium sp.）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）單菌株和不同菌株聯合對黑曲霉菌菌絲的抑制效果及對劍麻莖腐病的田間防治效果，結果表明，參試菌株能顯著抑制黑曲霉菌的菌絲生長，降低劍麻莖腐病田間發病率44%～75%。黃雪蘭等（2019）研究了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、深綠木霉（T. atroviride）和寡雄腐霉（Pythium oligandrum）對劍麻莖腐病病原菌黑曲霉菌的抑制效果，發現深綠木霉和哈茨木霉對黑曲霉菌菌落生長的拮抗系數分別為Ⅱ級（木霉菌絲占據平皿2/3以上）和Ⅲ級（木霉菌絲占據平皿1/3～2/3），寡雄腐霉菌菌絲能快速覆蓋病原菌菌落，深綠木霉、哈茨木霉和寡雄腐霉的培養濾液能顯著抑制黑曲霉菌的孢子萌發。【本研究切入點】目前，國內外尚未有關于劍麻葉片上形成圓形、近圓形或長橢圓形黑色斑塊，病部中央凹陷，偶有紅褐色至黑色膠狀分泌物等類似癥狀病害的相關報道。【擬解決的關鍵問題】采用常規組織分離法、分離菌致病性測定、致病菌形態特征觀察和分子生物學方法鑒定廣西劍麻葉片黑斑病的致病菌，并采用平板對峙培養法和載玻片孢子萌發法研究4種不同生防菌對劍麻黑斑病致病菌菌絲生長和孢子萌發的抑制效果，以期篩選出抑菌效果好，能在生產上推廣應用的生防菌種類，為指導劍麻種植企業有效開展該病害防治提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試生防菌：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）菌株B11由廣西大學農學院植物保護系黎起秦教授惠贈;解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株YZ14-3、哈茨木霉菌株GZ-5和深綠木霉菌株ST-1由廣西大學農學院植物保護系韋繼光教授惠贈。供試劍麻苗：品種為H.11648，來源于廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所劍麻基地。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌分離與純化 于2019年5月先后在廣西農墾紅山農場有限公司、廣西農墾山圩農場有限公司、廣西農墾東方農場有限公司、廣西農墾新光農場有限公司和廣西農墾東風農場有限公司劍麻地采集帶有圓形或長橢圓形黑色凹陷斑塊的病葉，采用組織分離法分離病原菌（方中達，1998）。將病葉剪成約15 cm長的小段，用浸透75%酒精的脫脂棉反復擦拭葉片表面3次，然后用滅菌的解剖刀削去病部表面組織，取病健交界處的葉肉組織塊（約0.5 cm×0.5 cm）置于PDA培養基上，28 ℃培養3 d，待組織塊長出菌物后，立即挑取不同菌落邊緣的菌絲轉接至新的PDA培養基上進行培養。采用單孢分離法（董娟華等，2009）純化各分離物。獲得的純菌株在PDA斜面試管中培養2 d后于4 ℃冰箱中保存備用。

1. 2. 2 病原菌致病性測定 將保存的菌株轉接至PDA培養基上，28 ℃活化培養3 d后用于接種試驗。選取長勢一致的健康3齡劍麻苗作為接種對象。采用葉片針刺法接種，試驗設3個處理：處理1（有傷接種），用浸透75%酒精的脫脂棉反復擦拭葉片后用無菌水沖洗，滅菌濾紙吸干葉表水分，以滅菌解剖針刺傷葉片表皮，取培養好的菌絲塊，將菌絲面貼合針刺傷口處，用濕潤的無菌脫脂棉覆蓋在接種處，然后用無菌保鮮膜包裹好;處理2（無傷接種），葉片不做刺傷處理，直接接種菌絲塊，其余操作方法同處理1;處理3（對照），用無菌瓊脂塊代替菌絲塊接種，其余操作方法同處理1。每個菌株每處理接種5株劍麻苗（5次重復）。各處理劍麻苗放置在（28±1）℃，相對濕度約50%的環境培養5 d后觀察記錄發病情況。

1. 2. 3 病原菌形態特征觀察和測量 分別在病原菌培養初期和后期挑取菌絲及孢子制成臨時玻片，于徠卡生物顯微鏡下觀察、測量菌絲及孢子形態、大小并拍照。

1. 2. 4 病原菌分子鑒定 用Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取病原菌基因組DNA，分別用ITS引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3'）（White et al.，1990）和EF1-α引物（EFl-728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAG AAGG-3'，EF1-986R：5'-TACTTGAAGGAACCCTT ACC-3'）（Carbone and Kohn，1999）進行PCR擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系20.0 ?L：10×PCR Buffer 2.0 ?L，Taq Plus DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 ?L，正、反向引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，dNTP（10 mmol/L）0.5 ?L，DNA模板2.0 ?L，ddH2O 14.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環;72 ℃延伸8 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測（150 V，100 mA，20 min）后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ 網站（NCBI）的BLAST程序比對分析序列。采用MEGA 5.0分析序列，利用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，自展數據重復抽樣1000次。

1. 2. 5 生防菌對病原菌菌絲生長的影響 采用平板對峙法（張俊杰等，2019），先將供試拮抗真菌菌株和細菌菌株分別在PDA培養基和NA培養基上活化。用滅菌打孔器（直徑0.5 cm，下同）取活化好的病原菌菌絲塊放置在PDA培養基中央，再取同等大小的生防菌菌落塊對稱放置在距離病原菌菌絲塊2 cm的位置，使3個菌落塊成一條直線。對照以滅菌瓊脂塊代替生防菌菌落塊。每處理5次重復，置于28 ℃培養箱中培養。培養3 d后，觀察記錄菌絲生長情況。

通過測量菌株B11和YZ14-3對病原菌的抑菌圈半徑評價其抑菌效果。通過測定菌株GZ-5和ST-1對病原菌菌絲生長的拮抗系數評定其對病原菌菌絲生長的抑制效果。

1. 2. 6 生防菌培養濾液對病原菌菌絲生長的影響

用滅菌打孔器取活化培養的生防菌菌塊轉接入含有100 mL PD液體培養基的三角瓶（250 mL）中振蕩培養（28 ℃，130 r/min），培養3 d后，用細菌過濾器（直徑0.22 ?m）過濾除去菌體，保留濾液備用。用滅菌打孔器取病原菌菌絲塊置于PDA培養基中央，在其周圍不同角度2 cm處放置3片浸透生防菌濾液的濾紙片（直徑0.5 cm），對照用無菌水代替生防菌濾液，每處理5次重復，于28 ℃培養箱中培養，培養3 d后觀察記錄菌絲生長情況。

1. 2. 7 生防菌培養濾液對病原菌孢子萌發的影響

利用1.2.6中獲得的生防菌培養濾液配制病原菌孢子懸浮液（濃度約為106個/mL）。用移液槍取100.0 ?L孢子懸浮液置于干凈的載玻片上，將載玻片放入墊有濕潤濾紙的培養皿中于28 ℃培養箱中培養，對照用無菌水配制孢子懸浮液，每處理3次重復。培養24 h后，在顯微鏡下觀察孢子萌發情況，每個重復隨機觀察200個孢子，計算萌發率。

1. 3 統計分析

試驗數據采用Excel 2016和SPSS v19.0進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 病原菌分離及致病性測定結果

從5個農場劍麻地的150個黑斑病病組織塊中共分離出6種不同的菌物，依據菌落形態、顏色、大小將分離物分別編號為JMHB1、JMHB2、JMHB3、JMHB4、JMHB5和JMHB6。其中，編號為JMHB1的菌株分離率最高，達96%。

根據柯赫氏法則，將不同菌株接種至長勢一致的健康3齡劍麻苗葉片，5 d后發現接種菌株JMHB1的劍麻苗葉片表現出與田間病害相似的癥狀（圖1），且能從接種葉片的發病部位分離出與JMHB1相同的菌物，而其他菌株處理的劍麻苗未表現出癥狀或表現的癥狀與田間不一致。由此說明，菌株JMHB1是劍麻黑斑病害的致病菌。

2. 2 病原菌菌株JMHB1形態特征

病原菌菌株JMHB1在PDA培養基上生長迅速，直徑為0.5 cm的菌絲塊在28 ℃培養箱中培養3 d后即可長滿整個平板（直徑9 cm）。菌落初期灰白色，貼近平板表面的菌絲較致密，氣生菌絲較稀疏（圖2-A），幼嫩菌絲有分支和分隔（圖2-B），菌落邊緣有大量白色粉末狀物，即分生孢子及孢子鏈（圖2-C），隨著培養時間延長，菌落逐漸變深灰色至橄欖綠色（圖2-D），老熟菌絲顏色較深，分隔較多（圖2-E）。共產生3種孢子，即分生孢子、節孢子和厚垣孢子（圖2-F），分生孢子圓形至橢圓形，無色透明，0～1個隔膜，大小為4.4～13.8 ?m×2.2～5.6 ?m;節孢子短柱狀，無色透明，單生或多個連接形成孢子鏈，大小為5.5～17.9 ?m×2.1～3.5 ?m;厚垣孢子深褐色，圓形或橢圓形，單生或多個連接成孢子鏈，大小為4.5～9.6 ?m×4.5～8.6 ?m。在PDA培養基上未見產生分生孢子器。菌株JMHB1的形態特征與Crous等（2006）描述的新暗色柱節孢（Neoscytalidium dimidiatum）相一致。

2. 3 菌株JMHB1的ITS和EF1-α序列擴增及分析

菌株JMHB1的ITS和EF1-α PCR產物測序后分別獲得長度為555和293 bp的序列片段（圖3）。將獲得的序列在NCBI中進行BLAST比對分析，發現獲得的ITS序列（MT705646）/EF1-α序列（MT733516）與GenBank中N. dimidiatum的模式菌株CBS 499.66的ITS序列（AY819727）和EF1-α序列（EU144063）的同源性高，分別為100%和99.65%。

從GenBank中分別下載N. dimidiatum及其近似種菌株的ITS序列和EF1-α序列，以Neofusicoccum vitifusiforme為外群構建系統發育進化樹。基于ITS和EF1-α序列構建的系統發育進化樹顯示，菌株JMHB1與N. dimidiatum的模式菌株CBS 499.66及其他已公開發表的N. dimidiatum菌株聚為一類（圖4和圖5）。

綜合致病性測定、形態特征觀察和分子鑒定結果表明，引起廣西劍麻葉片黑斑病的病原菌為新暗色柱節孢[N. dimidiatum （Penz.） Crous & Slippers]。

2. 4 生防菌對菌株JMHB1菌絲生長的抑制效果

對峙培養發現，4種生防菌均能抑制菌株JMHB1的菌絲生長（圖6）。其中，菌株YZ14-3和B11的抑制效果最好，其抑菌圈半徑分別為13.22和12.14 mm，二者間差異不顯著（P>0.05，下同），且均顯著高于對照（P<0.05，下同）。菌株ST-1和 GZ-5對JMHB1菌絲生長的拮抗系數分別為Ⅲ級和Ⅳ級，即菌株ST-1和GZ-5的菌落分別占據平板的1/3～2/3和1/3以下（表1）。對照菌株JMHB1的菌絲能正常長滿整個PDA平板。菌株JMHB1菌落與生防菌菌落交接處的菌絲變黑，挑取變黑的菌絲鏡檢，發現菌絲隘縮、斷裂（圖7）。

2. 5 生防菌培養濾液對菌株JMHB1菌絲生長的抑制效果

試驗結果表明，菌株ST-1和GZ-5的培養濾液對菌株JMHB1的菌絲無抑制作用（圖8-B和圖8-E），與對照（圖-C和圖8-F）無顯著差異，而菌株YZ14-3和B11的培養濾液可抑制菌株JMHB1的菌絲生長（圖8-A和圖8-D）。挑取菌株YZ14-3和B11的培養濾液處理的菌株JMHB1菌絲鏡檢發現菌絲隘縮、斷裂（圖7）。

2. 6 生防菌培養濾液對菌株JMHB1孢子萌發的抑制效果

觀察發現，菌株JMHB1的孢子可在菌株YZ14-3、B11、ST-1和GZ-5的培養濾液中萌發，但萌發率存在差異，平均萌發率分別為31.67%、32.37%，68.63%和76.63%，各生防菌處理的孢子萌發率均顯著小于對照（表2）。

3 討論

王會芳等（2018）研究發現，蒂腐色二孢和新暗色柱節孢侵染劍麻葉片分別引起黑斑病和潰瘍病。由蒂腐色二孢引起的劍麻黑斑病病斑圓形至長條形，中間灰白色，邊緣黑褐色;由新暗色柱節孢引起的劍麻潰瘍病病斑為圓形小斑點，紅褐色至黑褐色，稍凹陷，有時病部開裂，病部有黑褐色顆粒物。本研究描述的劍麻黑斑病病原菌為新暗色柱節孢，其癥狀不同于王會芳等（2018）報道的劍麻黑斑病和潰瘍病，也不同于趙艷龍等（2007）描述的劍麻黑斑病。由此可見，新暗色柱節孢侵染劍麻后可表現出不同的癥狀。為與劍麻其他黑斑病相區分，本研究發現的劍麻葉片黑色凹陷斑塊病害暫命名為劍麻Neoscytalidium黑斑病（劍麻新暗色柱節孢黑斑病）。新暗色柱節孢除侵染劍麻引起不同癥狀的病害外，也侵染芒果（Padin et al.，2005）和柑橘類果樹（Polizzi et al.，2009），表現出不同的癥狀。

新暗色柱節孢是Crous等（2006）在研究葡萄座腔菌科18個屬100多個種的系統發育時重新建立的一個新組合，其包含有多個異名，常見的有雙分圓酵母（Torula dimidiate）、雙間柱頂孢（Scytalidium dimidiatum）、芒果那特拉斯菌（Nattrassia mangiferae）、圓酵母樣亨德遜霉（Hendersonula toruloidea）和雙間殼梭孢菌（Fusicoccum dimidiatum）。新暗色柱節孢寄主廣泛，可引起多種植物病害，如火龍果（Hylocereus undulatus Britt）褐斑病（Lan and He，2012）、麻風樹（Jatropha curcas L.）根腐病（Machado et al.，2012）和潰瘍病（陸志翔等，2015）、垂葉榕（Ficus benjamina L.）梢枯病（Fernández-Herrera et al.，2017）、虎尾蘭（Sansevieria trifasciata Prain）葉枯病（Kee et al.，2017）。此外，新暗色柱節孢還能引起人類皮下組織感染（Sigler et al.，1997）、皮膚癬病和鼻竇炎（Bakhshizadeh et al.，2014）、肺部感染（Dionne et al.，2015），以及灰海豚（Grampus griseus G.）肺部感染（Elad et al.，2011）。本研究中，菌株JMHB1的ITS序列（MT705646）和EF1-α序列（MT733516）均與GenBank中新暗色柱節孢模式菌株CBS 499.66的相關序列高度同源，構建的系統發育樹顯示菌株JMHB1與模式菌株CBS 499.66及其他已公開發表的新暗色柱節孢菌株聚在一起。結合菌株的致病性測定結果和形態特征，將廣西劍麻葉片上黑色凹陷斑塊病害的病原菌鑒定為新暗色柱節孢（N. dimi-diatum），該研究結果為我國首次報道。

關于新暗色柱節孢所致病害的防治，國內外已有報道。陳靜等（2015）從土壤中篩選出1株皮氏類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae），對峙培養發現皮氏類芽孢桿菌對新暗色柱節孢的抑菌帶寬度為0.9 cm。李界秋等（2016）測定8種殺菌劑對火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢菌絲的抑制作用，結果表明，苯醚甲環唑、咪鮮胺、苯甲·丙環唑和克菌·戊唑醇對新暗色柱節孢菌絲生長具有良好的抑制效果，離體防治效果均在90%以上。王會會等（2016）研究了13種化學藥劑對火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢的室內抑菌效果，發現50%多菌靈可濕性粉劑、40%氟硅唑乳油和12.5%烯唑醇乳油對病菌菌絲生長的抑制效果較好。Luong等（2016）研究發現弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）和多發酵芽孢桿菌（B. polyfermenticus）對新暗色柱節孢菌絲生長的抑菌效果好，對峙培養結果表明抑菌圈直徑達2 cm以上。張振華等（2019）從火龍果不同生境中分離到5株火龍果潰瘍病菌新暗色柱節孢強拮抗性菌株，溫室盆栽防效測定結果表明，7-6-1和10-4-6對火龍果潰瘍病的平均防效較高，分別為50.41%和48.85%。

植物病害生物防治是近年來的研究熱點。Gotor-Vila等（2017）研究了解淀粉芽孢桿菌CPA-8的揮發性有機化合物（1，3-戊二烯、3-羥基-2-丁酮和噻吩）對桃灰霉病菌（Botrytis cinera）、桃褐腐病菌（Moni-linia fructicola）和櫻桃核果鏈核盤菌（M. laxa）菌絲生長的抑制效果，發現1.35 ?L/mL的噻吩對參試病菌菌絲生長的抑制率均達82%以上，揮發性有機化合物能顯著降低果實腐爛率。哈茨木霉微生物肥與化肥配施可提高番茄果實的總可溶性糖和維生素C含量，降低硝酸鹽積累量，提高土壤微生物種群數量，改善土壤肥力（趙政等，2018）。利用深綠木霉作為種子包衣劑處理玉米種子，可顯著降低玉米猝倒病菌燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）和黃色鐮刀菌（F. culmorum）的感染率（Coninck et al.，2020）。謝紅輝（2016）研究發現，哈茨木霉、深綠木霉、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能使桑樹根腐病病菌可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）的菌絲畸形膨大、斷裂;哈茨木霉和深綠木霉的菌絲緊緊纏繞可可毛色二孢菌絲;可可毛色二孢的分生孢子在枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的培養濾液中不能萌發，且發生孢子解體。本研究中，深綠木霉ST-1、枯草芽孢桿菌 B11和解淀粉芽孢桿菌YZ14-3對新暗色柱節孢菌絲生長均有較強的抑制作用，且能導致新暗色柱節孢菌絲隘縮、斷裂，推斷其對新暗色柱節孢的抑菌機制主要是生長競爭和產生抗生物質。本研究中未觀察到木霉菌絲纏繞新暗色柱節孢菌絲，且新暗色柱節孢的孢子在芽孢桿菌培養濾液未發生解體，究其原因可能是同一種生防菌對不同病原菌的抑菌機制存在差異。哈茨木霉GZ-5、深綠木霉ST-1、枯草芽孢桿菌B11和解淀粉芽孢桿菌YZ14-3對劍麻Neoscytalidium黑斑病的田間防治效果有待在后續研究中評價。

4 結論

廣西劍麻葉片上癥狀為圓形、近圓形或長橢圓形黑色凹陷斑塊病害的病原菌為新暗色柱節孢[N. dimidiatum（Penz.） Crous & Slipper]，這是我國首次報道新暗色柱節孢侵染劍麻引起黑斑病。劍麻生產上可選擇和搭配使用解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、深綠木霉及其商品制劑防治劍麻Neoscytalidium黑斑病（劍麻新暗色柱節孢黑斑病）。

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（責任編輯 麻小燕）