基于轉錄組測序的芒果過敏原基因鑒定及表達分析

閆慧清 吳宗敏 田旭 楊兆云 黃絨

摘要：【目的】基于芒果果實和葉片的轉錄組測序結果，篩選出潛在過敏原基因，并分析其在不同組織中的表達模式，為選育低過敏性的芒果品種提供理論依據。【方法】提取芒果果實和葉片總RNA，構建cDNA文庫，利用Illumina HiSeq 4000進行轉錄組測序（測序讀長為150 bp），從原始數據中篩選獲得Clean reads，并利用Trinity進行組裝，得到Unigenes，將其提交至NR數據庫和Pfam數據庫進行功能注釋，從而篩選潛在的過敏原基因。通過實時熒光定量PCR （qRT-PCR）測定過敏原基因在不同組織中的表達情況。通過Cluspro分析果實中高表達過敏原與IgE抗體結合的表位區域。【結果】經組裝獲得230242條Transcripts和99328條Unigenes，二者的N50分別為2278和1183 bp，說明組裝完整性較好。通過NR數據庫和Pfam數據庫共篩選到66個潛在的芒果過敏原基因，主要被注釋為花粉過敏原、Bet v家族和NADPH-依賴FMN還原酶等，其中有6個不表達，其余60個均表達，其中有24個主要在果實中表達，其他36個基因在葉片中高表達。qRT-PCR檢測結果顯示，9個過敏原基因在芒果葉片和果實中表達量檢測結果與RNA-Seq轉錄組表達分析結果基本相符;除幾丁質酶基因c64821.graph_c0在葉片中表達量顯著高于花和果實（P<0.05，下同）外，其他過敏原基因在花中的表達量顯著高于葉片和果實。在RCSB PDB數據庫搜索獲得在果實中高表達的過敏原c61327.graph_c0的同源蛋白結構域（PDB：4Z8W），其與IgE結合表位的氨基酸序列為74-SFRQEVKTEKHGEFKVHLPFSVSEHV-99。不同物種過敏原蛋白的結合表位氨基酸序列具有高度保守性。【結論】不同芒果過敏原基因具有組織表達特異性，大部分基因在花中高表達，說明對食用芒果后產生過敏反應的人群應避免觸摸芒果花等組織。c61327.graph_c0與其他物種的同源過敏原產生交叉過敏反應。

關鍵詞： 芒果; 過敏原; 轉錄組; 基因鑒定; 表達分析

中圖分類號： S667.703.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1771-09

Identification and expression analysis of mango allergens according to transcriptome sequencing

YAN Hui-qing， WU Zong-min， TIAN Xu， YANG Zhao-yun， HUANG Rong

（School of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang? 550025，China）

Abstract：【Objective】The potential allergen genes were determined and the expression profiles in different tissues were evaluated using transcriptome sequencing of mango leaves and fruits to provide a theoretical basis for breeding lower allergenic mango cultivars. 【Method】The total RNA was extracted from mango fruits and leaves. Transcriptome sequen-cing（150 bp reads） using HiSeq 4000 was performed after the cDNA libraries construction. Unigenes were obtained with Trinity assemble of clean reads. The unigenes related to potential allergen genes were annotated using NR and Pfam databases. The expression levels of allergen genes in different tissues were determined using real - time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. The epitopes of the allergen highly expressed in fruits combined with IgE antibody were obtained by Cluspro analysis. 【Result】A total of 230242 transcripts and 99328 unigenes were obtained. The N50 lengths of transcripts and unigenes were 2278 and 1183 individually，indicating the high assembly quality. Identified 66 potential allergen genes using NR and Pfam databases，including pollen allergens， Bet v family and NADPH-dependent FMN reductase. Six allergens showed no expression， 60 showed expression. There were 24 allergens and 36 allergens highly expressed in fruits and leaves，respectively. The qRT-PCR test showed that the expression of nine allergen genes in mango leaves and fruits was largely consistent with the RNA-Seq transcriptome expression analysis. Except that the expression of chitinase gene c64821.graph_c0 in leaves was significantly higher than flowers and fruits（P<0.05，the same below），the others were significantly expressed in flowers than leaves and fruits. The allergen c61327. graph_c0 highly expressed in fruit was used as the template to obtain homologous protein domain（PDB：4Z8W） by searching in the RCSB PDB database， the amino acid sequences combined with IgE epitope was 74-SFRQEVKTEKHGEFKVHLPFSVSEHV-99. The amino acid sequences of binding epitopes of allergen protein from different species were highly conserved. 【Conclusion】Different mango allergen genes have tissue expression specificity. Most genes are highly expressed in flowers，suggesting that people with allergic reactions after eating mango should avoid touching mango flowers. C61327.graph_c0 has cross-allergenic reactions with homologous allergens of other species.

Key words： Mangifera indica Linn; allergens; transcriptome; gene identification; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660554）; Guizhou Joint Fund Project（Qinkehe LH〔2015〕7772）

0 引言

【研究意義】芒果（Mangifera indica Linn）屬漆樹科，是我國熱帶和亞熱帶重要的水果，分布在廣西、海南和貴州等省（區）（Wu et al.，2012），其果實營養豐富，具有抗菌和抗癌作用（Noratto et al.，2010）。除鮮食外，芒果果實還可加工食用（Fasoli and Righe-tti，2013）。由于芒果中含有大量過敏原，不同芒果品種中過敏原的種類差異不明顯，部分人群在接觸或食用芒果后均會產生超敏反應（Kinder et al.，1999）。芒果引起的過敏反應不容忽視，其高發生率不僅與芒果的過敏原密切相關，還與其他食物或吸入性過敏原產生交叉反應有關。芒果的過敏原與特異性B細胞產生的IgE抗體Fc段受體I（IgE-Fc reception 1）結合形成復合體，再結合肥大細胞和嗜堿性粒細胞，導致機體處于過敏狀態（Tsujimura et al.，2008）。由于相似的表位結構域具有相同的免疫活性，因此芒果的過敏原與樺樹花粉、開心果、可可和木瓜等均有交叉反應（谷冬梅和李會強，2015）。通過轉錄組全面系統地評價芒果中潛在過敏原及轉錄水平的表達模式，并通過同源比對得到芒果與其他物種過敏原交叉反應的物質基礎，分析主要過敏原與IgE抗體結合的過敏表位，對選育低過敏性的芒果品種及防止交叉過敏現象具有重要意義。【前人研究進展】Wellhausen等（1996）通過IgE檢測方法首次從芒果中鑒定出分子量為35 kD的過敏原蛋白，且與樺樹花粉過敏原Bet v 1的蛋白氨基酸序列同源性較高，可產生交叉反應。Funes等（1999）通過IgE檢測方法從芒果的果肉和果皮粗提取物中鑒定出不同分子量的9個過敏原蛋白。Renner等（2008）利用芒果過敏病人的血清在芒果果肉中鑒定獲得分子量為27 kD的過敏原蛋白。Tsai等（2017）通過Allergome數據庫（http：//www.allergome.org/index.php）搜索獲得已報道的13個芒果過敏原，主要包括Man I 1、Man I 2、Man I 3和幾丁質酶，前3種過敏原分別屬于核糖體蛋白、NADH質體醌氧化還原酶亞基和細胞色素c血紅素附著蛋白。其中，重組Man I 1已在大腸桿菌中表達純化，可用于芒果過敏反應的免疫治療。幾丁質酶是體內防御真菌和病蟲害的植物保護酶，其在人體中的含量可作為哮喘人群血清的檢測指標（Goldman et al.，2012），表明幾丁質酶具有免疫學特性。此外，芒果的過敏原還包括抑制蛋白（Profilin）類（閆慧清等，2017）。該類抑制蛋白主要存在于植物的花粉中，可結合骨架蛋白并控制肌動蛋白聚合從而產生口腔過敏反應綜合癥（Song et al.，2008），表明抑制蛋白也具有免疫學特性。芒果中的前纖維蛋白與蘋果中的過敏原Mal d 4具有較高的同源性且兩者的空間構象極相似，表明兩者極易發生交叉反應（夏宏林等，2012）。隨著基因組學的發展，Illumina測序技術為探究芒果基因的功能和表達提供了較好的平臺。如Wu等（2014）以芒果品種Zill的果肉和果皮為研究材料，通過轉錄租測序共組裝得到54000個轉錄本;Dautt-Castro等（2015）對未成熟和成熟芒果果實進行轉錄組測序，挖掘軟化相關基因并分析其他營養特性的差異;Hoang等（2015）通過Illumina測序技術測定分析芒果在成熟過程中的生理過程、功能成分、采后管理和果實品質的變化;Zhao等（2017）通過Illumina測序技術分析得到菊科植物豚草（Ambrosia artemisiifolia）花粉中的過敏原。【本研究切入點】目前未見有關利用Illumina測序技術鑒定芒果中過敏原基因及其表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過Illumina測序技術鑒定得到芒果中過敏原基因并分析其轉錄水平的表達模式，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測過敏原基因在葉片、花和果實中的表達量，并對果實中高表達過敏原進行表位分析，為培育低致敏性芒果品種提供理論依據。

1 材料和方法

1. 1 試驗材料

供試芒果品種為臺農1號。RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR[?]Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及其他分子試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器設備：Aglient 2100生物分析儀（美國）、Illumina HiSeq 4000（San Diego，CA，USA）和實時熒光定量PCR儀（Qiagen，Rotor-Gene Q2 PLex）。

1. 2 樣品采集和RNA提取

采集芒果果實和葉片，立即置于液氮中冷凍，機械研磨成細粉，-80 ℃保存;使用RNA純化試劑盒分離芒果果實和葉片的總RNA。首先，采用Oligo（dT）的磁珠從總RNA中分離出poly（A） mRNA，隨機打斷mRNA片段，并以這些打斷的k-mer片段為模板合成并純化cDNA后，連接接頭。從中選擇合適的片段進行PCR擴增從而構建cDNA文庫，采用Agilent 2100生物分析儀對該文庫進行定量鑒定。

1. 3 轉錄組測序及數據組裝

采用Illumina HiSeq 4000進行轉錄組測序，測序讀長為150 bp，委托北京百邁客生物科技有限公司完成。從原始數據中濾除雜質，包括5%以上未知堿基的reads和低質量reads（含50%以上Q值≤10堿基的reads），最終篩選獲得Clean reads。使用Trinity組裝數據，將獲得的所有Unigenes提交至NR（NCBI non-redundant protein database，http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數據庫進行序列比對及功能注釋。

1. 4 過敏原基因篩選及其表達分析

基于Unigenes在NR和Pfam數據庫中的比對及注釋結果，篩選出葉片和果實中與過敏原相關的所有基因，并對過敏原進行描述。基于RNA-Seq轉錄組數據，采用FPKM（Fragments per kilobase million）方法計算各過敏原基因的表達水平。

采用Trizol試劑提取芒果花、葉片和芒果果實的總RNA，并利用反轉錄PCR（RT-PCR）試劑盒和oligo dT-adaptor引物反轉錄合成cDNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以cDNA為模板，采用FastStart DNA Master SYBR Green I試劑盒進行qRT-PCR檢測。過敏原基因和內參基因β-actin的引物如表1所示。擴增程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，進行30個循環。設3次生物學重復。采用2?△△Ct方法計算過敏原基因的相對表達量，并利用SPSS 22.0進行方差分析。

1. 5 過敏原蛋白的蛋白質結構分析和過敏表位預測

根據篩選出的過敏原基因，通過ORF（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）推導出過敏原的氨基酸序列，并通過PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）搜索過敏原的蛋白結構域。使用Cluspro進行蛋白—蛋白對接，根據結構簇得分選擇裝配體三維結構，得到能量較低的大簇對接結構（E=0.40Erep+?0.40Eatt+600Eelec+1.00EDARS）（Kozakov et al.，2013）。利用Discovery studio 4.5獲得對接蛋白序列（Swellmeen et al.，2017），并將其提交至ESPript 3.0（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）進行序列比對。

2 結果與分析

2. 1 芒果轉錄組數據分析結果

芒果果實和葉片的轉錄組數據已提交到NCBI的GEO數據庫（No. GSE142427）。基于轉錄組測序結果，經過濾除雜后獲得17.63 Gb Clean reads，各樣品Clean reads均達8.36 Gb，Q30堿基百分比在94.58%及以上，共生成11751123個Contig，組裝共得到230242條Transcripts和99328條Unigenes，二者的N50分別為2278和1183 bp，說明組裝完整性較好。由圖1可知，長度為200～300 bp、300～500 bp、500～1000 bp、1000～2000 bp和>2000 bp的Unigenes所占比例分別為39.75%、26.16%、17.13%、9.59%和7.37%，平均長度為680.53 bp。

2. 2 芒果果實和葉片中過敏原基因的鑒定結果

利用NR數據庫和Pfam數據庫對47949個Unigene進行注釋，結果表明46303個（96.57%）均在NR和Pfam數據庫中注釋成功，通過功能注釋信息，從中共篩選出66個潛在的過敏原基因，如表2所示。根據過敏原種類不同，66個過敏原基因大致可分為三大類，第一類為花粉過敏原，主要為擴展類（Expansin-like）蛋白;第二類為Bet v家族，包括致敏異黃酮還原性蛋白Bet v 6.0102（c88876.graph_c0和c82555.graph_c0）、Bet v I家族及其他病程相關蛋白，其中，Bet v I家族成員c45493.graph_c0、c51367.graph_c0、c94579.graph_c0和c40982.graph_c0，均被注釋為過敏原Pru ar 1-like;第三類包括NADPH-依賴FMN還原酶、Ana o 2、Can a 1、Mal d 1、Hsp90/Hsp、Pis v 2.0201、Cla h和醛脫氫酶家族等。

2. 3 轉錄組表達分析結果

基于RNA-Seq轉錄組表達分析結果（圖2）顯示，66個過敏原基因中，有6個不表達，其余60個均表達，其中有24個主要在果實中表達，其他36個基因在葉片中高表達。根據FPKM值，將66個過敏原基因分為四大類，第一類有6個基因，在果實和葉片中均不表達;第二類有12個基因，僅在果實中高表達;第三類有14個基因，僅在葉片中高表達;第四類有34個基因，在果實和葉片中均表達，但存在明顯差異。尤其是c61327.graph_c0、c49299.graph_c0和c44502.graph_c0基因在果實中非常高，說明對這3種過敏原過敏的人群應避免食用芒果果實。

2. 4 過敏原在不同組織中的表達分析結果

選取在芒果葉或果實中高表達的9個過敏原基因，采用qRT-PCR檢測其在花、葉和果實中的表達量，結果如圖3所示。c44502.graph_c0、c49299.graph_c0、c61297.graph_c0、c17261.graph_c0和c61327.graph_ c0基因在果實中的表達量高于葉片，其他基因在葉片中的表達高于果實，與上述RNA-Seq轉錄組表達分析結果基本相符。除c64821.graph_c0基因在葉片中表達量顯著高于花和果實（P<0.05，下同）外，其他過敏原基因在花中的表達量顯著高于葉片和果實。

2. 5 過敏原蛋白結構分析結果

以芒果果實中高表達的過敏原c61327.graph_c0為模板，在RCSB PDB數據庫搜索獲得同源蛋白結構域（PDB：4Z8W），并通過Cluspro進行c61327.graph_c0和IgE-Fc模擬對接，獲得過敏原蛋白結合表位的氨基酸序列（74-SFRQEVKTEKHGEFK-VHL PFSVSEHV-99）（圖4-A）。通過NCBI的BLASTp搜索其他物種的同源序列，結果發現c61327.graph_c0與可可樹（Theobroma cacao）中的花粉過敏原Ole e1（GenBank登錄號EOY03810.1）高度同源，氨基酸序列相似性達71%（圖4-B），與土瓶草（Cephalotus follicularis）的花粉過敏原Ole e1（GenBank登錄號GAV60102.1）和黃麻（Corchorus capsularis）的花粉過敏原Ole e1（GenBank登錄號OMP03537.1）的氨基酸序列相似性分別是62%和49%。不同物種過敏原蛋白結合表位的氨基酸序列（圖4-B中陰影部分）具有高度保守性，表明芒果過敏原c61327.graph_c0與其他物種的同源過敏原序列產生交叉過敏反應。

3 討論

Illumina測序技術已用于葡萄（Tu et al.，2016）、甜橙（Hu et al.，2016）和菠蘿（Sharma et al.，2017）等多種物種果實中功能物質基因的研究及挖掘。本研究經芒果葉片和果實的轉錄組測序分析，共獲得17.63 Gb的Clean reads，組裝后獲得99328條Unigenes，其中，長度為1 kb以上的Unigenes有16848條。與武紅霞等（2016）將6.16 Gb的Clean reads組裝后獲得54207條Unigenes相比，本研究組裝得到的Unigenes數量較多，可更好地覆蓋基因組信息。本研究發現，96.57%的Unigene在NR和Pfam數據庫中比對成功，推測其余3.43%的轉錄本是由于基因組數據庫注釋信息的限制和芒果EST信息的缺乏而無法進行功能注釋。此外，部分Unigenes被注釋為“假設性蛋白”“預測性蛋白”和“假定性蛋白”，表明仍需通過進一步的分子生物學實驗驗證其生物學功能。

本研究將組裝得到的Unigenes在Pfam和NR數據庫中進行比對及注釋，共鑒定出66個過敏原基因，其編碼蛋白分別為花粉過敏原、致病相關蛋白Bet v I家族蛋白、抑制蛋白、幾丁質酶和過敏原Alt a 1等。其中，花粉過敏原的擴展蛋白是芒果的主要過敏原，存在于許多物種的花粉中，被認為是廣泛的過敏原，能引起食物和花粉之間的交叉反應;芒果過敏原致病相關蛋白Bet v I家族和幾丁質酶參與植物對真菌和細菌的防御（Diaz-Perales et al.，1999）;芒果過敏原抑制蛋白是一種肌動蛋白的結合蛋白，通過結合肌動蛋白而防止高等植物細胞骨架的形成（Song et al.，2008），在芒果的花粉中表達量較高且具有較高的免疫活性。芒果過敏原Alt是一種NADPH-依賴FMN還原酶，與過敏原性密切相關，推測其在芒果過敏的免疫治療中具有潛在的應用價值（Moreno et al.，2016;Gabriel et al.，2017）。目前一些高表達的過敏原可使用IgE方法進行檢測，并利用體外重組進行純化，用于免疫治療（吳序櫟等，2010）。

雖然芒果葉片和果實存在許多過敏原，但其表達水平不盡相同。本研究采用qRT-PCR檢測9個過敏原基因在3種不同組織中的表達情況，其中在果實和葉片的檢測結果與RNA-Seq轉錄組表達分析結果基本相符;除幾丁質酶基因c64821.graph_c0在葉片中表達量顯著高于花和果實外，其他過敏原基因均在花中的表達量顯著高于果實和葉片，表明對食用芒果后產生過敏反應的人群應避免觸摸芒果的花組織。此外，本研究通過對芒果果實中高表達過敏原c61327.graph_c0進行同源比較及表位分析，推測芒果過敏原c61327.graph_c0與其他物種的同源過敏原產生交叉過敏反應。此前也有研究表明不同物種間的過敏原蛋白氨基酸序列高度同源，且過敏原結合表位具有相同的免疫活性（Song et al.，2008），如對芒果花粉過敏的人群，也對白樺樹和木瓜的產生過敏反應（Renner et al. 2008）。今后應基于轉錄組測序，對本研究獲得芒果的潛在過敏原進行體外表達和純化等研究，并通過基因工程手技術減低過敏原基因的表達或培育低過敏的芒果品種。

4 結論

不同芒果過敏原基因具有組織表達特異性，大部分基因在花中高表達，說明對食用芒果后產生過敏反應的人群應避免觸摸芒果花等組織。c61327.graph_c0與其他物種的同源過敏原產生交叉過敏反應。

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（責任編輯 陳 燕）