重樓皂苷Ⅰ通過調控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及促進細胞凋亡的初步研究

張翠　王珺　王凱波　林偉　孫田

[摘要]目的：探討重樓皂苷Ⅰ（PPⅠ）是否通過調控長鏈非編碼RNA CEBPA-AS1（LncRNA CEBPA-AS1）/微小RNA-195-5p（miR-195-5p）通路影響瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡。方法：原代培養人瘢痕疙瘩成纖維細胞，使用不同濃度的PPⅠ處理細胞，si-CEBPA-AS1、pcDNA-CEBPA-AS1分別轉染至細胞;采用MTT檢測細胞增殖;應用流式細胞儀檢測細胞周期;采用流式細胞術檢測細胞凋亡率;采用qRT-PCR法檢測LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達量;雙熒光素酶報告實驗檢測LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p的靶向關系。結果：與Control組比較，PPⅠ可明顯降低細胞存活率、S期細胞比例、Bcl-2蛋白水平、LncRNA CEBPA-AS1的表達水平，提高G0/G1期細胞比例、凋亡率、miR-195-5p的表達水平，差異均有統計學意義（P<0.05）。與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組細胞存活率、S期細胞比例降低，G0/G1期細胞比例、凋亡率升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。雙熒光素酶報告實驗證實LncRNA CEBPA-AS1可靶向調控miR-195-5p;轉染pcDNA-CEBPA-AS1可明顯逆轉PPⅠ對細胞增殖、細胞周期及凋亡的作用。結論：重樓皂苷Ⅰ可能通過下調LncRNA CEBPA-AS1的表達及上調miR-195-5p的表達從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及促進細胞凋亡。

[關鍵詞]重樓皂苷Ⅰ;LncRNA CEBPA-AS1;miR-195-5p;瘢痕疙瘩;成纖維細胞;增殖;凋亡

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）09-0012-05

Polyphylin Ⅰ Inhibits Keloid Fibroblast Proliferation and Promotes Apoptosis by Regulating the LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p Pathway

ZHANG Cui，WANG Jun，WANG Kai-bo，LIN Wei，SUN Tian

（Department of Dermatology，Shenyang Seventh People's Hospital，Shenyang 110000，Liaoning，China）

Abstract： Objective? To investigate whether PPⅠ affects keloid fibroblast proliferation and apoptosis by regulating the LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p pathway. Methods? Primary culture of human keloid fibroblasts， and treatment of cells with different concentrations of PPⅠ. si-CEBPA-AS1 and pcDNA-CEBPA-AS1 were transfected into cells respectively. MTT was used to detect cell proliferation. Application of flow cytometry to detect cell cycle. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. The expression of LncRNA CEBPA-AS1， miR-195-5p was detected by qRT-PCR method. The dual luciferase report experiment detected the targeting relationship between LncRNA CEBPA-AS1 and miR-195-5p. Results? Compared with the Control group， PPⅠ could significantly reduce the cell survival rate， S phase cell ratio， the protein level of Bcl-2， the expression level of LncRNA CEBPA-AS1， the differences were statistically significant （P<0.05）， and increase the G0/G1 phase cell ratio， apoptosis rate， the expression level of miR- 195-5p （P<0.05）. Compared with the si-NC group， the cell survival rate and the proportion of S-phase cells in the si-CEBPA-AS1 group was decreased （P<0.05）， and the proportion of cells in the G0/G1 phase and the apoptosis rate were increased （P<0.05）. The dual luciferase report experiment confirmed that LncRNA CEBPA-AS1 could target miR-195-5p. Transfection of pcDNA-CEBPA-AS1 could obviously reverse the effects of PPⅠ on cell proliferation， cell cycle and apoptosis. Conclusion? PolyphylinⅠmay inhibit the proliferation of keloid fibroblasts and promote apoptosis by down-regulating the expression of LncRNA CEBPA-AS1 and up-regulating the expression of miR-195-5p.

Key words： Polyphylin Ⅰ; LncRNA CEBPA-AS1; miR-195-5p; keloid; fibroblast; proliferation; apoptosis

瘢痕疙瘩是皮膚纖維組織增生異常引起的，天然植物提取物對瘢痕具有明顯的抑制作用，但關于其作用機制尚未完全闡明[1-3]。重樓是我國中醫藥治療中的重要藥物之一，其主要成分重樓皂苷Ⅰ（Polyphylin Ⅰ，PPⅠ）具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[4]。但重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的影響尚不明確。長鏈非編碼RNA CEBPA-AS1（LncRNA CEBPA-AS1）在肝癌中呈高表達，并可能促進肝癌發生及發展[5]。通過生物信息學分析顯示微小RNA-195-5p（miR-195-5p）可能是LncRNA CEBPA-AS1的靶基因，miR-195-5p在肺癌細胞中表達下調，上調其表達可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲[6]。但重樓皂苷Ⅰ是否可通過調控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路影響瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探討重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的影響，探究其對LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路的調控作用。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：收集2017年10月-2018年10月于筆者醫院進行瘢痕疙瘩手術的10例患者為研究對象，其中男6例，女4例，年齡22～63歲，平均（43.25±6.35）歲，取材部位：前胸部3例，肩部2例，耳垂部5例，采取樣本時瘢痕疙瘩處于增生活躍期、質地較硬且局部充血，患者表現為毛細血管擴張且伴隨瘙癢或疼痛，瘢痕疙瘩不存在破損或感染，均未接受任何治療。

重樓皂苷Ⅰ購自中國藥品生物制品檢定所;DMEM培養基購自美國Gibco公司;胰蛋白酶、Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;CEBPA-AS1小分子干擾RNA（si-CEBPA-AS1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-195-5p寡核苷酸模擬物（miR-195-5p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司;pcDNA3.1購自上海聯邁生物工程有限公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;反轉錄、熒光定量檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;MTT購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司;兔抗人Bax、Bcl-2抗體購自美國Santa Cruz公司;HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養瘢痕疙瘩成纖維細胞[7]：采用原代分散細胞培養法分離培養瘢痕疙瘩成纖維細胞，將切取的瘢痕疙瘩組織置于膠原酶溶液內消化4h，剪碎，置于膠原酶溶液中消化，分散成纖維細胞，過濾，離心后進行洗滌，加入含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基進行傳代培養，待成纖維細胞鋪滿瓶底，置于光學顯微鏡下觀察，加入0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養，取第4代細胞進行后續實驗。

1.2.2 實驗分組：瘢痕疙瘩成纖維細胞接種于6孔板（3×104個/孔），分別加入含有不同濃度（2mg/L、10mg/L、20mg/L）的重樓皂苷Ⅰ的培養基處理24h[8]，分別記作PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組。同時加入含0.1% DMSO的培養液中培養24h作為Control組。后續實驗設置si-NC組（si-NC轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞）、si-CEBPA-AS1組（si-CEBPA-AS1轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞）、PPⅠ-H+pcDNA組（pcDNA轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，加入含有濃度為20mg/L重樓皂苷Ⅰ的培養基處理24h）、PPⅠ-H+pcDNA-CEBPA-AS1組（pcDNA-CEBPA-AS1轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，加入含有濃度為20mg/L重樓皂苷Ⅰ的培養基處理24h）。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細胞接種于96孔板（5×103個/孔），每孔加入MTT溶液20μl，繼續培養4h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5min，應用酶標儀檢測各孔吸光度值（OD值）。計算細胞存活率（%）=實驗處理組OD值/Control組OD值×100%。

1.2.4 檢測細胞周期：取各組瘢痕疙瘩成纖維細胞，調整細胞密度為1×106個/毫升，加入預冷PBS，4℃條件下經3 000r/min離心5min，棄上清，加入500μl PBS重懸細胞，加入70%乙醇（3.5ml），充分混勻，4℃條件下孵育24h，取出單細胞懸液，4℃條件下經3 000r/min離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，加入50μl RNaseA，37℃條件下水浴30min，加入PI染液（450μl），4℃條件下孵育30min，應用流式細胞儀與Flowjoe軟件分析各組細胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占細胞比例。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/毫升，加入預冷PBS，4℃條件下經3 000r/min離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，加入500μl結合緩沖液重懸細胞，加入5μl Annexin V-FITC充分混勻，加入5μl PI充分混勻，室溫振蕩搖晃孵育10min，應用FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達水平：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA。LncRNA CEBPA-AS1正向引物5-AGAACCATTCCAAGAGCCCA-3，反向引物5-TGGCAACCTTAAACCACAGC-3;GAPDH正向引物5-GGAGCGAGATCCCTCC AAAAT-3，反向引物5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3;miR-195-5p正向引物5-AATATTGGCTGTGCTGCTCC3，反向引物5-GGACCCTGTTCACACTCTGA-3;U6正向引物5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3，反向引物5-GGAACGCTTCACG AATTTG-3，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系：SYBR Green Master Mix 10微升/孔，正反向引物0.8微升/孔，cDNA 1微升/孔，ddH2O補足體系至20μl;反應條件：95℃ 2min循環1次，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共循環40次。LncRNA CEBPA-AS1以GAPDH為內參，miR-195-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p靶向關系：LncBase v.2預測顯示LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p存在結合位點，利用基因突變技術將結合位點進行突變，構建野生型載體WT-CEBPA-AS1與突變型載體MUT-CEBPA-AS1，分別將miR-NC、miR-195-5p mimics與WT-CEBPA-AS1、MUT-CEBPA-AS1共轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，轉染24h，收集細胞，檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測Bax、Bcl-2蛋白表達：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗稀釋液（1：1 000），4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液（1：2 000），室溫孵育1h，TBST洗滌，曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學分析：采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計量資料以（x?±s）表示且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;G0/G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細胞存活率、G0/G1期、S期細胞比例比較差異均具有統計學意義（P<0.05），而不同組別間G2/M期細胞比例比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細胞凋亡率、Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表2。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞中LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p表達量的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組LncRNA CEBPA-AS1的表達水平顯著降低，miR-195-5p的表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達水平比較差異均具有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 干擾LncRNA CEBPA-AS1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的影響：與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組細胞存活率顯著降低，G0/G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）;G2/M期細胞比例無明顯變化（P>0.05）;細胞凋亡率顯著升高，Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2，表4。

2.5 LncRNA CEBPA-AS1靶向調控miR-195-5p：LncBase v.2預測顯示LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p存在結合位點，見圖3。共轉染WT- CEBPA-AS1的細胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-195-5p組熒光素酶活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;共轉染MUT-CEBPA-AS1的細胞實驗中，miR-195-5p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統計學意義（P>0.05），見表5。與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組miR-195-5p的表達水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與pcDNA組比較，pcDNA-CEBPA-AS1組miR-195-5p的表達水平顯著降低（P<0.05）。見表6。

2.6 LncRNA CEBPA-AS1過表達可降低重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的作用：與PPⅠ-H+pcDNA組比較，PPⅠ-H+pcDNA-CEBPA-AS1組細胞存活率顯著升高，G0/G1期細胞比例顯著降低，S期細胞比例顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;G2/M期細胞比例無明顯變化（P>0.05）;細胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4，表7。

3? 討論

瘢痕疙瘩成纖維細胞過度增殖與細胞外基質過量沉積可造成瘢痕疙瘩的形成，目前臨床主要采用藥物進行預防及治療，但治療效果不佳，因而尋找治療效果好且副作用小的藥物具有重要意義，苦參堿、辣椒素等藥物具有抗炎、止癢、抗腫瘤等作用，可明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖[9-10]。因而本研究仍積極探尋新型治療藥物并探究其可能作用機制，為提高瘢痕疙瘩的治療效果提供參考依據。

重樓是治療腫瘤的重要藥物之一，其具有清熱解毒、消腫止痛等作用，重樓皂苷Ⅰ是重樓的主要活性物質，其具有抗腫瘤等作用，并可作用腫瘤細胞凋亡及抑制細胞增殖[11-13]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后細胞存活率顯著降低，G0/G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯變化，提示重樓皂苷Ⅰ可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，并可誘導細胞周期阻滯于G1期，且呈劑量依賴性。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達上調可通過促進線粒體釋放細胞色素C而激活Capase級聯反應從而促進細胞凋亡[14]。本研究結果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡率顯著升高，Bax表達上調，Bcl-2表達下調，且隨著藥物劑量的增加而顯著變化，提示重樓皂苷Ⅰ可促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

LncRNA CEBPA-AS1在口腔鱗狀細胞癌中表達上調，其高表達量與口腔鱗狀細胞癌患者預后不良相關，并可能通過CEBPA/Bcl2促進腫瘤發生[15]。本研究結果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后LncRNA CEBPA-AS1的表達水平顯著降低，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示重樓皂苷Ⅰ可能通過下調LncRNA CEBPA-AS1的表達從而發揮作用。本研究結果顯示干擾LncRNA CEBPA-AS1表達后瘢痕疙瘩成纖維細胞存活率顯著降低，G0/G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Bax表達上調，Bcl-2表達下調，提示干擾LncRNA CEBPA-AS1表達可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、誘導細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡。同時本研究采用雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實LncRNA CEBPA-AS1可靶向結合miR-195-5p，并可負向調控miR-195-5p的表達。研究表明miR-195-5p在非小細胞肺癌中可能發揮抑癌基因作用[16]。沉默AGAP2-AS1可能通過上調miR-195-5p的表達從而抑制子宮內膜癌細胞遷移及侵襲[17]。本研究結果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-195-5p的表達水平顯著升高，且隨著藥物劑量的增加而顯著升高，提示重樓皂苷Ⅰ可能通過上調miR-195-5p的表達從而發揮作用。為進一步探究重樓皂苷Ⅰ是否可通過調控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路而發揮作用，本研究將LncRNA CEBPA-AS1過表達載體與重樓皂苷Ⅰ共同處理瘢痕疙瘩成纖維細胞，結果顯示細胞存活率顯著升高，G0/G1期細胞比例顯著降低，S期細胞比例顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，提示LncRNA CEBPA-AS1過表達可降低重樓皂苷Ⅰ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及促進細胞凋亡，其作用機制可能為通過下調LncRNA CEBPA-AS1的表達而上調miR-195-5p的表達從而發揮作用，可為進一步揭示瘢痕疙瘩發病機制奠定實驗基礎，還可為闡釋重樓皂苷Ⅰ治療瘢痕疙瘩的分子機制提供參考依據。

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[收稿日期]2020-08-13

本文引用格式：張翠，王珺，王凱波，等.重樓皂苷Ⅰ通過調控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及促進細胞凋亡的初步研究[J].中國美容醫學，2021，30（9）：12-16.