阿維A聯合阿達木單抗調控MAPK/NF-κB通路對銀屑病小鼠模型的療效及Th17/Th22、DC水平的影響研究

楊洪　李慧　馬紅艷

[摘要]目的：探討阿維A聯合阿達木單抗調控絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）/核轉錄因子κB（NF-κB）通路對銀屑病小鼠模型的療效及輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）/Th22、樹突狀細胞（Dendriticcells，DC）水平的影響研究。方法：將BALB/c雌性小鼠作為研究對象，背部涂抹咪喹莫特乳膏構建銀屑病小鼠模型，并隨機分為模型組、干預組即阿維A組、阿達木單抗組以及阿維A聯合阿達木單抗組，模型組注射生理鹽水，干預三組分別給予阿維A灌胃、阿達木單抗靜脈注射以及阿維A灌胃聯合阿達木單抗靜脈注射，干預治療7d后動態觀察各組小鼠皮損變化情況并進行皮損面積和嚴重程度指數（Psoriasis area and severity index，PASI）評分，比較各組小鼠外周血炎癥因子表達水平以及Th17/Th22細胞以及DC水平，采用Western-blot法測定各組小鼠皮損組織中NF-κB蛋白水平。結果：與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠鱗屑程度和鱗屑厚度明顯減輕，紅斑面積縮小，皮損癥狀明顯緩解，其中阿達木單抗聯合阿維A組皮損改善程度最顯著，PASI評分上升趨勢最緩慢。干預后7d，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠血清IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子水平、外周血Th17/Th22細胞及DC水平相比模型組明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;且聯合用藥組各炎癥因子表達水平明顯低于阿達木單抗組和阿維A組，差異有統計學意義（P<0.05）。阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組皮損組織NF-κB蛋白相對表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;且聯合用藥組NF-κB蛋白水平相對表達水平明顯低于阿達木單抗組、阿維A組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：阿維A聯合阿達木單抗可能通過調控MAPK/NF-κB通路影響銀屑病小鼠Th17/Th22、DC水平，從而抑制炎癥反應和改善銀屑病癥狀。

[關鍵詞]銀屑病;阿維A;阿達木單抗;MAPK/NF-κB通路;Th17/Th22;樹突狀細胞

[中圖分類號]R758.63? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）09-0007-05

Effect of Acitretin Combined with Adalimumab on the Efficacy of MAPK/NF-κB Pathway in Psoriasis Mouse Model and the Effect of Th17/Th22 and DC Levels

YANG Hong，LI Hui，MA Hong-yan

（Department of Dermatology，Children's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of acitretin combined with adalimumab on the regulation of MAPK/NF-κB pathway in psoriasis mouse model and the effects of Th17/Th22 and dendritic cells （DC）. Methods? BALB/c female mice were used as subjects， and a psoriasis mouse model was constructed by applying imiquimod cream on the back and randomly divided into the model group， the acitretin group， the adalimumab group and the adalimumab combined with acitretin group. The model group was injected with normal saline， and the three groups were given intravenous administration of acitretin， intravenous adalimumab， and intravenous injection of acitretin combined with adalimumab. After 7 days of intervention treatment， the changes of skin lesions in each group were observed dynamically and the Psoriasis area and severity index （PASI） score was obtained. The expression levels of peripheral blood inflammatory factors and Th17/ Th22 cells and DC levels in each group were compared， and the NF-κB protein levels in the skin lesions of each group were determined by Western-blot method. Results? Compared with the model group， the degree of scaly and scaly thickness of the adalimumab group， the acitretin group and the adalimumab combined with acitretin group were significantly reduced， the area of erythema was reduced， and the symptoms of skin lesions were significantly relieved. Among them， the adalimumab combined with acitretin group had the most significant improvement in skin lesions， and the PASI score increased the slowest. On the 7th day after the intervention， the serum levels ofvIL-17， IL-21， IL-23， TNF-α and IFN-γ were significantly decreased in the adalimumab group， the acitretin group， and the adalimumab combined with acitretin group compared with the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the expression levels of inflammatory factors in the combination group were significantly lower than those in the adalimumab group and the acitretin group （P<0.05）. In addition， the relative expression levels of NF-κB protein in the adalimumab group， the acitretin group and the adalimumab combined with acitretin group were significantly decreased （P<0.05）. And the level of NF-κB protein in the combination group was significantly lower （P<0.05）. And the combination group was significantly lower than the adalimumab group and the acitretin group （P<0.05）. Conclusion? Acitretin combined with adalimumab may inhibit the levels of Th17/Th22 and DC in psoriasis mice by regulating MAPK/NF-κB pathway， thereby inhibiting inflammatory response and improving symptoms of psoriasis.

Key words： psoriasis; acitretin; adalimumab; MAPK/NF-κB pathway; Th17/Th22; dendritic cells

銀屑病（Psoriasis）是一種由多重因素誘導的免疫異常性和慢性炎癥皮膚病，患處皮膚常呈現為紅色丘疹且表面覆蓋有數層銀白色的鱗屑[1]。銀屑病發病累及范圍大且病情反復遷延不愈，目前臨床上尚無良好的根治方案，只能通過藥物對疾病進程進行控制和減輕患者痛苦[2]。因此進一步深入研究銀屑病發病機制對于銀屑病治療具有重要價值。銀屑病發病機制比較復雜，以往臨床上常認為銀屑病發生機制與輔助性T細胞17（T helper cell17，Th17）/Th22細胞免疫失衡存在緊密聯系，現有研究發現Th17細胞也是參與銀屑病發生發展的重要T細胞之一，白細胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作為Th17細胞的重要分泌因子，可以通過刺激促炎性細胞因子和趨化因子表達導致機體發生炎癥和組織損傷[3]。樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）屬于抗原呈遞細胞，具有激活免疫反應細胞和活化初始T細胞作用，可以啟動免疫應答和誘導免疫耐受，與銀屑病等慢性皮膚炎癥發生發展存在密切聯系[4]。核轉錄因子κB（NF-κB）MAPK/NF-κB信號通路是參與細胞增殖、分化、黏附和凋亡等過程的一條重要信號通路，還可通過調節DC成熟和活化過程影響銀屑病發生發展[5]。MAPK/NF-κB信號通路同時可以誘導細胞促炎因子表達、聚集、激活過程，是一種典型炎癥反應調節細胞信號轉導通路，該信號通路可以通過影響炎癥因子表達參與銀屑病發生機制。阿維A是目前臨床上常用于治療銀屑病的一種有效藥物，但阿維A對人體的免疫系統作用機制仍需要進一步研究[6]。阿達木單抗屬于全人源抗TNF-α單克隆抗體，很多國家已批準用于中重度銀屑病的治療[7]。本文通過觀察阿維A聯合阿達木單抗對銀屑病小鼠模型的療效并研究其作用機制及對Th17/Th22、DC水平的影響，同時檢測MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平，旨在為銀屑病發病機制和臨床用藥治療提供參考。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑：選擇72只體重18～20g的成年BALB/c雌性小鼠（動物來源：廣東省醫學實驗動物中心）;其中阿維A購自重慶華邦制藥有限公司，阿達木單抗注射液為Vetter Pharma-Fertigung GmbH & Co. KG生產，購自健生貿易有限公司，批準文號JXSS0900001。

1.2 模型建立與藥物干預方法：以80mg/kg劑量在所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉完全后將小鼠背部毛刮除干凈，暴露出2cm×3cm左右皮膚面積后，每天在小鼠背部皮膚上涂抹濃度為5%咪喹莫特乳膏40mg，連續涂抹兩周。造模期間每天對小鼠背部皮膚拍照并進行皮損評分，造模后1周對背部患處皮膚進行病理學檢測，并使用顯微鏡觀察表皮厚度以及炎癥浸潤程度。確定小鼠銀屑病模型建立成功后，將小鼠隨機分為模型組、對照組（阿維A組和阿達木單抗組）和研究組，每組各18只，單籠進行飼養。其中對照組分別給予阿維A和阿達木單抗治療，研究組給予阿維A聯合阿達木單抗治療，其中阿維A為灌胃給藥，5mg/（kg·d），0.4毫升/（次·天） ;阿達木單抗為靜脈注射給藥，將1mg溶于0.5ml葡萄糖溶液中注射給藥，模型組靜脈注射等量生理鹽水，治療周期為兩周。

1.3 各組小鼠療效評估：根據小鼠銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度（Psoriasis area and severity index，PASI）評分對各組小鼠藥物干預療效進行評估，采用肉眼觀察并采用相機記錄方式，計算銀屑病小鼠鱗屑、皮損紅斑及浸潤增厚積分。PASI評分標準：無為0分（創面皮膚未見紅斑和鱗屑，且皮損與正常皮膚水平面齊平）;輕度為1分（創面皮膚表面覆有細碎鱗屑，皮膚顏色呈淡紅色且皮損平面稍高于正常皮膚水平面）;中度為2分（皮膚大部分面積存在皮損，表面覆有片狀鱗屑且呈中度隆起且斑塊邊緣呈圓狀或者斜坡狀）;重度為3分（皮膚幾乎全部面積存在皮損，表面覆有厚層鱗屑且重度隆起，皮損顏色呈深紅色）;極重度為4分（皮膚全部皮損）[8]。對四組小鼠皮損鱗屑、浸潤和紅斑嚴重程度進行評分，并將三個維度評分相加得總評分，取各組小鼠各評分均值繪制評分隨時間的變化趨勢圖。

1.4 各組小鼠Th17/Th22細胞及DC水平測定：干預兩周后從各組小鼠眼球取血，采用流式細胞儀（廠家：賽默飛世爾，型號：Attune NxT）檢測Th17、Th22等輔助性T細胞以及DC數量比例。

1.5 各組小鼠血清炎癥因子水平測定：干預7d后從各組小鼠眼球取血，2 500r/min離心15min得到分離后血清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定各組小鼠樣品中IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-α水平含量。

1.6 Western-blot法測定皮損組織NF-κB蛋白水平測定：對小鼠進行脫頸處死，按照九格法剪取各組小鼠皮損處組織并經超聲裂解，采用BCA法對蛋白進行定量，使用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品進行分離后，將蛋白轉移到PVDF膜上，使用封閉液將樣品于室溫下封閉1h，將膜轉入封閉液稀釋的一抗（pNF-κB以及NF-κB稀釋1 000倍），以β-actin為內標。然后于4℃條件下孵育過夜后使用洗液進行洗滌，化學發光法顯色，X射線底片曝光。

1.7 統計學分析：采用SPSS 19.0統計分析軟件對本研究不同組別以及處理前后的各項指標間差異進行評價。多組間采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 各組小鼠療效比較：與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠用藥干預后鱗屑程度和鱗屑厚度明顯減輕，紅斑面積縮小，皮損癥狀明顯緩解;與阿達木單抗組和阿維A組相比，阿達木單抗聯合阿維A組皮損改善程度更顯著，皮膚更加光滑，浸潤程度更輕，見圖1。四組小鼠的鱗屑、浸潤及紅斑嚴重程度評分以及三者總積分見圖2。與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三個維度評分及總分上升趨勢更加緩慢，其中阿達木單抗聯合阿維A組評分上升趨勢最慢。

2.2 各組血清炎癥因子表達水平比較：干預后7d，與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠血清IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;且聯合用藥組各炎癥因子表達水平明顯低于阿達木單抗組、阿維A組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 各組Th17/Th22細胞及DC水平比較：干預后7d，與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠Th17/Th22細胞及DC水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;且聯合用藥組表達水平明顯低于阿達木單抗組、阿維A組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 各組皮損組織NF-κB蛋白水平比較：干預后7d，與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組皮損組織NF-κB蛋白相對表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;且聯合用藥組NF-κB蛋白水平相對表達水平明顯低于阿達木單抗組、阿維A組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3～4。

3? 討論

近來有研究顯示樹突狀細胞（DCs）的異常活化與銀屑病發生發展存在緊密關系，DCs可以通過分泌多種免疫因子啟動和調節固有免疫和獲得性免疫，與銀屑病的炎性浸潤存在重要相關性。抗原成分會促進DC活化并產生IL-23、IL-1β和TNF-α、IL-6等前炎癥因子，這些細胞因子會進一步誘導分泌IL-17和IL-22等炎性因子，從而促進CD4+ T細胞（Th17、Th22以及Th1）介導產生的獲得性免疫反應[9]。核轉錄因子Kappa B（Nuclear transcription factor Kappa B，NF-κB）是與多種自身免疫病發病機制關系緊密的信號通路之一。機體內IL-17、IL-12以及TNF-α炎癥因子水平升高以及其他相關刺激可以激活NF-κB信號通路，被活化后的NF-κB通路可使靶基因發生轉錄以及促使T細胞分化，對炎性因子產生正反饋調節，從而放大炎性信號并介導免疫應答發生[10]。激活的MAPK/NF-κB信號通路密切參與基因轉錄、細胞凋亡過程，可引起DNA鏈斷裂和細胞解體。同時MAPK/NF-κB信號通路能夠促進TNF-α、IL-6等免疫細胞表達水平，可通過調節炎癥反應過程和皮膚免疫系統干預銀屑病炎癥反應，故該信號通路對于銀屑病發生機制和發生發展至關重要[5]。阿達木單抗是以TNF-α為作用靶點一種全人源化單克隆抗體，通過與TNF-α發生特異性結合來阻斷TNF-α與相關受體TNF受體之間的相互作用來發揮抗炎功效，對于類風濕關節炎、銀屑病以及炎癥性腸病等免疫介導的炎性反應過程具有顯著干預作用[7]。維甲酸是一種維生素A衍生物，具有調控細胞形態、細胞增殖、凋亡等廣泛生物活性，近來研究證實其具有顯著的免疫調節功能，臨床廣泛用于治療痤瘡、銀屑病以及皮膚角化[6]，但目前兩種藥物聯合用于銀屑病治療臨床效果尚需進一步研究。

本文研究結果發現與模型組相比，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠用藥干預后鱗屑程度和鱗屑厚度明顯減輕，紅斑面積縮小，皮損癥狀明顯緩解;與阿達木單抗組和阿維A組相比，阿達木單抗聯合阿維A組皮損改善程度更顯著，皮膚更加光滑，浸潤程度更輕。三個干預組小鼠PASI三個維度評分及總分上升趨勢相比模型組更加緩慢，其中阿達木單抗聯合阿維A組評分上升趨勢最慢。說明阿達木單抗和阿維A可以顯著降低銀屑病小鼠皮損程度，而阿達木單抗聯合阿維A治療效果更佳。另外本研究結果顯示干預后7d，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組小鼠血清炎癥因子水平相比模型組明顯下降，且聯合用藥組炎癥因子及Th17/Th22細胞及DC水平改善更顯著。說明阿達木單抗聯合阿維A可以顯著調節小鼠體內免疫細胞和炎癥因子水平，發揮明顯抗炎作用，且兩者之間存在協同作用。Yamaoka T等[11]研究發現銀屑病小鼠體內存在免疫失衡，經阿達木單抗處理后小鼠皮損組織和血清中Th17類細胞因子（IL-17）、Th1類細胞因子（IFN-γ）和Treg類細胞因子（IL-10）表達水平均發生明顯下降，與本文研究結果相一致，說明阿達木單抗可能是通過影響Th1、Th17、Th22以及Treg等免疫細胞水平，從而干預炎癥細胞因子分泌量影響免疫反應，進一步改善銀屑病小鼠發生皮損嚴重程度。Eriksson E[12]研究證實DCs異常活化是銀屑病發病的重要因素，DCs活化后分泌的炎性因子如IL-12和IL-23會進一步激活T淋巴細胞，最終引發銀屑病。已有研究表明阿維A可以通過抑制MAPK/NF-κB通路阻斷DC成熟過程，從而可以阻斷DC對抗原的遞呈作用，發揮抑制T細胞依賴性免疫應答的功能[13]。故推測NF-κB通路在銀屑病炎癥反應過程和免疫調節過程中發揮重要作用。張彩晴等[14]研究結果表明P物質可以激活人角質形成細胞（HaCaT）MAPK/NF-κB信號通路，導致細胞呈多角形形態變化，而阿維A可以降低陽性細胞表達率以及MAPK/NF-κB表達水平，說明阿維A可以通過抑制MAPK/NF-κB信號通路并下調NF-κB表達。另外Fuentes-Duculan J等[15]研究發現TNF-α可以顯著促進外周血DC分化和成熟過程，從而引發炎癥反應。本文研究結果顯示干預后7d，阿達木單抗組、阿維A組和阿達木單抗聯合阿維A組三組皮損組織NF-κB蛋白相對表達水平相比模型組明顯下降，且聯合用藥組NF-κB蛋白水平相對表達水平明顯低于阿達木單抗組、阿維A組。主要是由于阿達木單抗作為TNF-α抑制劑，可以降低體內TNF-α等炎癥因子表達，抑制DC分化成熟，從而抑制炎癥反應，減輕小鼠銀屑病癥狀[16]。而阿維A通過抑制MAPK/NF-κB通路阻斷DC成熟過程，降低機體免疫應答。故阿達木單抗和阿維A聯合應用可以發揮協同作用，通過抑制MAPK/NF-κB信號途徑降低IL-12、IL-18等炎癥因子的表達，共同減輕炎性反應對銀屑病皮損的刺激[17]。

綜上所述，阿維A聯合阿達木單抗可能通過調控MAPK/NF-κB通路影響銀屑病小鼠Th17/Th22、DC水平，從而抑制炎癥反應和改善銀屑病癥狀。

[參考文獻]

[1]Takeshita J，Grewal S，Langan SM，et al.Psoriasis and comorbid diseases： Epidemiology[J].J Am Acad Dermatol，2017，76（3）：377-390.

[2]Blair HA.Brodalumab： a review in moderate to severe plaque psoriasis[J].Drugs，2018，78（4）：495-504.

[3]Yousefzadeh H，Azad FJ，Rastin M，et al.Expression of Th1 and Th2 cytokine and associated transcription factors in peripheral blood mononuclear cells and correlation with disease severity[J].Rep Biochem Mol Biol，2017，6（1）：102-111.

[4]Kim TG，Kim SH，Lee MG.The origin of skin dendritic cell network and its role in psoriasis[J].Int J Mol Sci，2017，19（1）：42-49.

[5]王靜，江從軍，陳秋.銀屑病患者血清IL-17、IL-22、IL-36與IL-36Ra水平的變化及其臨床意義[J].中國美容醫學，2019，28（8）：77-79.

[6]中華醫學會皮膚性病學分會.阿維A治療銀屑病專家共識（2017版）[J].中華皮膚科雜志，2017，50（6）：397-399.

[7]張瑞麗，朱小紅，華海康，等.阿達木單抗治療重度銀屑病14例臨床療效及安全性觀察[J].中華皮膚科雜志，2018，51（8）：604-606.

[8]賈玲芝，賈嬌.甲砜霉素聯合阿維A膠囊對尋常性銀屑病患者外周血VEGF，OPN，IL-17， IL-18表達的影響研究[J].中國美容醫學，2019，28（5）：69-71.

[9]Martini E，Wiken M，Cheuk S，et al.Dynamic changes in resident and infiltrating epidermal dendritic cells in active and resolved psoriasis[J].J Invest Dermatol，2017，137（4）：865-873.

[10]Vara D，Watt JM，Fortunato TM，et al.Direct activation of NADPH oxidase 2 by 2-deoxyribose-1-phosphate triggers nuclear factor Kappa B-dependent angiogenesis[J].Antioxid Redox Signal，2018，28（2）：110-130.

[11]Yamaoka T，Hayashi M，Tani M，et al.Value of ultrasonography findings for nail psoriasis before and after adalimumab administration[J].Clin Exp Dermatol，2017，42（2）：201-209.

[12]Eriksson E，Milenova I，Wenthe J，et al.Abstract 3662： Activation of CD40 while inhibiting IL6/STAT3 using oncolytic viruses induces mature DCs with high cytokine production but blocks PDL1 expression[J].Cancer Res，2017，77（13 Supplement）：3662.

[13]Dufrasne FE，Lucchetti M，Martin A，et al.Modulation of the NF-κB signaling pathway by the HIV-2 envelope glycoprotein and its incomplete BST-2 antagonism[J].Virology，2018，513（25）：11-16.

[14]張彩晴，王倩云，鄭龍，等.阿維A對P物質誘導的HaCaT細胞NF-κB表達的影響[J].中國麻風皮膚病雜志，2014，30（11）：643-646.

[15]Fuentes-Duculan J，Bonifacio KM，Hawkes JE，et al.Autoantigens ADAMTSL5 and LL37 are significantly upregulated in active Psoriasis and localized with keratinocytes， dendritic cells and other leukocytes[J].Exp Dermatol，2017，26（11）：1075-1082.

[16]陳晨，孟艷.血管緊張素Ⅱ對樹突狀細胞功能的影響[J].首都醫科大學學報，2017，38（5）：709-714.

[17]Carrascosa JM，Montecinos MT，Ballescá F，et al.Correlation between trough serum levels of adalimumab and absolute PASI score in a series of patients with psoriasis[J].J Dermatolog Treat，2018，29（2）：140-144.

[收稿日期]2020-07-07

本文引用格式：楊洪，李慧，馬紅艷.阿維A聯合阿達木單抗調控MAPK/NF-κB通路對銀屑病小鼠模型的療效及Th17/Th22、DC水平的影響研究[J].中國美容醫學，2021，30（9）：7-11.